HPLC-ELSD 法测定花丹安神合剂中N-甲基-反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量

2020-08-24张小利路发凯马梦杰

江苏科技信息 2020年18期

张小利，路发凯，马梦杰

（上海凯宝药业股份有限公司，上海201401）

0 引言

花丹安神合剂是以落花生枝叶为君药、丹参为臣药的现代中药复方制剂，具有良好的镇静、催眠作用，与传统苯二氮䓬类及其他催眠药相比，呈现出安全、副作用小的特点。物质基础研究表明，N-甲基-反式-4-羟基-L-脯氨酸和丹参素是其有效成分［1-3］，因此在新药研发过程中，建立以N-甲基-反式-4-羟基-L-脯氨酸和丹参素（丹参的指标性成分）为花丹安神合剂质量标准中的含量控制治疗具有重要意义［4］。本研究采用HPLC-ELSD 法测定了该制剂中N-甲基-反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量，方法简单，专属性强，以用于该制剂的质量控制。

1 材料

Agilent 1200 高效液相色谱仪，Empower 2 色谱工作站（美国安捷伦公司）；JY20002 检测器：Alltech®3300 ELSD 检测器；十万分之一电子天平（上海精密仪器有限公司）；SG5200HE 超声清洗器（上海冠特超声仪器有限公司）；H1650 台式高速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）。

1.1 试剂

乙腈为色谱纯，水为Millipore 制备的超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.2 试药

N-甲基-反式-4-羟基-L-脯氨酸（上海医药工业研究院中药室制备，纯度98.90%）；落花生枝叶（批号：20140618）、花丹安神合剂（批号：1408001）均由上海凯宝药业有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：YMC-Pack Polyamine Ⅱ色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：75%乙腈；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测器：Alltech®3300 ELSD 检测器；ELSD参数：漂移管温度48 ℃，气体流量1.8 L/min，增益1。理论塔板数按N-甲基-反式4-羟基-L-脯氨酸计算应不低于4 000。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取N-甲基-反式-4-羟基-L-脯氨酸标准品25.0 mg，置于25 mL量瓶中，于25 ℃环境温度下，加水溶解，摇匀，并稀释至刻度，过0.22 μm 滤膜过滤即得。

2.3 供试品溶液的制备

取本品5支，混匀，精密吸取花丹安神合剂2 mL，置于10 mL量瓶中，于25 ℃环境温度下，加水溶解，摇匀，并稀释至刻度，超声30 min，过0.22 μm 滤膜过滤即得。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取对照品溶液5，8，10，15，20 μL 进样，按上述色谱条件测定。以进样量（X，μg）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标进行线性回归，得N-甲基-反式-4-羟基-L-脯氨酸标准品的回归方程为Y=836.32X-1 069.2（r=0.999 8）。结果表明，标准品的进样量在5.00～20.00 μg 范围内与其峰面积积分值呈良好的线性关系。对照品色谱如图1所示。

2.5 精密度试验

精密吸取对照品N-甲基-反式-4-羟基-L-脯氨酸溶液10 μL 进样，重复6 次，测得峰面积RSD 为0.74%（n=6），表明该实验所用仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密吸取供试品溶液10 μL 进样分析，然后分别于0，1，2，4，8，24，48 h 时重复进样一次。测得峰面积的RSD 为1.73%，表明样品溶液在48 h 内稳定。

2.7 重复性试验

精密称取同一批样品6 份，按外标法计算含量，分别为99.56%，99.50%，99.60%, 99.59%，98.66%和99.22%，平均含量为99.22%，RSD 为0.46%。结果表明，本法重复性良好。

2.8 回收率试验

精密量取已知N-甲基-反式-4-羟基-L-脯氨酸含量的花丹安神合剂（批号：1408001）2 mL，共6 份，分别至10 mL 量瓶中，精密加入“2.2”项下N-甲基-反式-4-羟基-L-脯氨酸对照品溶液1.0 mL，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算回收率。结果表明：6 份供试品的平均加样回收率为96.76%，RSD 为1.53%。

2.9 样品含量测定

取3批花丹安神合剂样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，以外标法计算N-甲基-反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量，结果如表1所示。供试品溶液色谱，如图2所示。

3 讨论

3.1 色谱柱的选择

N-甲基-反式-4-羟基-L-脯氨酸的极性非常大，在C18 反相柱中无保留，因此选择正相行为的氨基柱进行分析。通过实验研究发现，N-甲基-反式-4-羟基-L-脯氨酸在YMC-Pack Polyamine Ⅱ色谱柱上有较好的保留，且分离度良好，因此我们选择YMCPack Polyamine Ⅱ色谱柱进行分析检测。

3.2 流动相的选择

在对流动相考察时，主要选择了甲醇水系统与乙腈水系统进行分析测试。首先，乙腈水系统作为流动相时，最初尝试了70%乙腈水系统，发现以蒸发光检测器为检测器的情况下，其基线漂移较大，且保留时间较短；之后尝试了85%乙腈为流动相，基线平稳，但是出峰时间较晚，经过比较，最终选择75%乙腈为流动相，N-甲基-反式-4-羟基-L-脯氨酸的保留时间为9.2 min 左右。

图1 N-甲基-反式-4-羟基-L-脯氨酸对照品HPLC-ELSD 色谱

表1 含量测定结果（n=3）

图2 供试品溶液中N-甲基-反式-4-羟基-L-脯氨酸HPLC-ELSD 色谱

3.3 检测器的选择

N-甲基-反式-4-羟基-L-脯氨酸紫外吸收非常弱，即使用末端吸收195 nm 作为检测波长，其色谱信号也比较微弱，检测信号不够灵敏，最终造成检测结果误差较大。此外，示差检测器是一种通用型检测器，但是由于其灵敏度低，对环境温度和流动相的波动影响较大，且基线不稳，与梯度洗脱不相容等缺点导致其不能应用于N-甲基-反式-4-羟基-L-脯氨酸的检测。

值得注意的是，蒸发光散射检测器（ELSD）也是一种通用型检测器，其响应值不依赖于样品的光学特性，检测灵敏度高于示差检测器，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测到。另外，在急变梯度时，低波长紫外检测器也受基线漂移的困扰，而ELSD 则不受这些限制，使得其分辨率更好、分离速度更快。鉴于ELSD的上述优点，采用该检测器对N-甲基-反式-4-羟基-L-脯氨酸样品进行纯度检测［5-9］。