不同类型秸秆还田对稻田土壤氨氧化微生物群落结构的影响

高珍珍, 王蓉, 龚松玲, 朱容, 刘章勇, 金涛, *

不同类型秸秆还田对稻田土壤氨氧化微生物群落结构的影响

高珍珍1, 王蓉2, 龚松玲1, 朱容1, 刘章勇1, 金涛1, *

1. 长江大学农学院, 湖北, 荆州 434025 2. 黄冈市农业科学院, 湖北, 黄冈 438000

为探讨油菜、蚕豆秸秆还田对稻田土壤氨氧化微生物群落结构的影响, 以江汉平原碱性潮土为研究对象, 设置单施化肥(NS)、油菜秸秆+单施化肥(RS)、蚕豆秸秆+单施化肥(BS)3个处理, 借助Illumina Miseq高通量测序平台, 探究不同类型秸秆还田对水稻土氨氧化古菌(AOA)和氨氧化细菌(AOB)群落多样性及群落结构的影响。结果表明, 不同类型秸秆还田对AOB群落Alpha多样性指数的影响强于AOA。对于AOB群落, 相比NS处理, 秸秆还田(RS和BS)处理提高了其多样性指数。其中, RS处理的多样性指数高于BS处理。Veen分析结果显示, 相比AOA, 不同类型秸秆还田对AOB基因序列OTU数目和分布的影响较大。其中, RS处理对OTU分布的影响强于BS处理。纲水平上, 不同类型秸秆还田对AOA群落的物种组成及物种相对丰度没有显著影响(>0.05)。但对于AOB群落, RS处理中unclassified_p__Proteobacteria的相对丰度比NS处理高2倍(<0.05), 比BS处理高1.45倍(>0.05); 相比NS处理, RS处理减少了norank_p__ammonia-oxidizing_bactera_ensemble的相对丰度, 而BS处理缺失这一物种。综上可知, 碱性潮土中AOB对不同类型秸秆还田的响应强于AOA。相比BS处理, RS处理对AOB群落结构的影响更大。

油菜秸秆; 蚕豆秸秆; 氨氧化古菌; 氨氧化细菌

0 前言

土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分, 其群落结构的变化能够直接影响土壤环境、养分条件等[1-2], 在土壤氮素循环过程中起着举足轻重的作用。硝化作用作为土壤氮素循环的关键环节之一, 与氮素有效利用率及硝酸盐淋溶、土壤酸化等密切相关[3-4]。硝化作用一般由2种微生物驱动完成, 即由亚硝化细菌驱动的氨氧化过程(Ammonia oxidation), 和由硝化细菌驱动的亚硝酸氧化过程(Nitrite oxidation)。其中, 氨氧化过程对整个硝化作用的速率起决定作用[5], 主要由含氨单加氧酶基因的氨氧化细菌(Ammonia oxidizing bacteria, AOB)和氨氧化古菌(Ammonia oxidizing archaea, AOA)驱动完成[6]。AOA和AOB的数量、群落结构直接影响土壤的氮素形态转化及其利用, 与土壤质量密切相关[7]。稻田干湿交替的灌溉方式为AOA和AOB提供了特殊的生境, 成为农田生态系统中硝化作用及其微生物生态研究的热点[8]。

水稻在我国粮食产业安全和农业经济发展中起重要作用, 是我国约60%以上的人口的主食[9]。研究表明, 秸秆还田能够增加水稻产量[9, 10], 改变土壤中氮固定相关微生物的多样性[11-12]、丰度, 进而影响硝化作用强度[13-15], 最终将影响整个农田生态系统氮素循环。兰木羚等[16]研究结果表明, 水稻、玉米、油菜、小麦秸秆还田均能提高水田土壤微生物的物种丰富度和优势度指数, 其中油菜和小麦秸秆还田对土壤微生物群落结构的影响最大。陈春兰等[17]研究表明, 水稻秸秆还田对AOB群落丰度和结构都没有显著影响, 甚至降低了amoA基因多样性指数和均匀度。刘晓蒨[18]研究表明, 小麦秸秆还田可以丰富AOA和AOB群落多样性和群落结构。高嵩涓[19]研究结果表明, 紫云英、油菜、黑麦草还田对双季稻田AOA和AOB amoA中的主要OTU(相对丰度大于0.8%)的影响不同。由此可见, 不同类型秸秆还田对稻田AOA和AOB群落多样性和群落结构的影响不同。

本文选取我国南方稻区两种常见的冬季作物-蚕豆、油菜秸秆进行水稻盆栽试验, 借助Illumina Miseq高通量测序平台探究不同类型秸秆还田对稻田土壤AOA和AOB群落多样性及群落结构的影响, 旨在揭示不同类型秸秆还田条件下稻田土壤氨氧化微生物群落多样性及群落结构的变化, 为深入研究秸秆还田条件下稻田硝化微生物调控土壤氮素机制提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2018年6月在湖北省荆州市长江大学农学院试验基地(30°6′N, 111°54′E)开展, 该地毗邻长江与南水北调工程, 属江汉平原辖内, 水源充沛, 年降水量1100 mm左右, 无霜期200 d, 温光资源充足, 具有雨热同季的典型亚热带季风性气候特点。土壤类型为潮土, 土壤母质为河流冲积物。试验前土壤肥力指标: pH 7.43, 有机质16.8 g·kg-1, 全氮1.59 g·kg-1, 碱解氮115.7 mg·kg-1, 速效磷5.17 mg·kg-1, 速效钾129.59 mg·kg-1。

1.2 试验设计

采用盆栽试验, 试验用盆为圆柱形塑料盆(32.5 cm× 28.5 cm)。试验前将供试土壤风干、粉碎, 去除碎石、杂草、根系等杂物, 过10 mm筛。每盆装25 kg过筛风干土, 置于试验基地露天区。试验设置3个处理: 单施化肥(NS); 油菜秸秆+单施化肥(RS); 蚕豆秸秆+单施化肥(BS), 每个处理4次重复。油菜与蚕豆秸秆经植株磨样机粉碎后与土壤充分混合均匀, 每盆还田量均为83.33 g。另外每盆施入5.43 g尿素, 6.94 g过磷酸钙, 1.94 g氯化钾。氮肥按照基肥: 分蘖肥: 穗肥=5:2.5:2.5施用, 磷肥一次性基施, 钾肥按照基肥、穗肥各50%施用。水稻供试品种为隆两优华占, 油菜秸秆供试品种为华油杂62号, 蚕豆秸秆供试品种为大青蚕豆。秸秆于水稻插秧前一周施入盆中, 水稻于2018年6月6日插秧, 每盆4穴, 每穴2苗, 9月20日收获。水稻生长期间均采用前期灌水、中期(分蘖末期)晒田、后期(齐穗后期)干湿交替的灌溉模式。

1.3 土壤样品采集

于2018年8月21日水稻齐穗期每盆选取3个点采集水稻耕作层(0—15 cm)土壤, 3份土样混合均匀, 并剔除杂草、根系、碎石等杂物后分成两部分。一部分土壤样品迅速用锡箔纸包裹, 放入液氮中进行冷冻处理, 带回实验室后, 置于-80℃超低温冰箱保存, 用作微生物测定分析。另一部分土壤样品用自封袋包裹带回实验室, 室内风干后用于测定土壤全碳、全氮、硝态氮、铵态氮、pH值。

1.4 土壤理化性质测定

土壤理化性质测定参照第三版《土壤农化分析》。土壤全氮、全碳使用元素分析仪(ECS4024, Costech, Italy)测定; 土壤硝态氮、铵态氮测定用2 mol·L-1KCl溶液浸提土样, 于室温下振荡、过滤后得到浸提液, 一部分直接用紫外分光光度计测定土壤NO3-, 另一部分采用靛酚蓝比色法测定土壤NH4+。pH采用电位法(水: 土=2.5:1)测定。

1.5 土壤DNA提取与PCR扩增

称取0.25 g超低温保存的土壤样品, 采用DNA试剂盒(MO BIO Laboratories Inc., Carlsbad, CA, USA)提取土壤DNA。提取的总DNA用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测, DNA的浓度和纯度(A260-280)用NanoDrop ND-1000UVevis分光光度计检测(ThermoScientific, Rockwood, TN, USA)。氨氧化古菌(AOA)和氨氧化细菌(AOB)的基因的PCR引物分别为Arch-amoAF (5’-STAATGGTCTGG CTTAGACG-3’) / Arch-amoAR (5’-GCGGCCAT CCATCTGTATGT-3’)[20]和b-amoA-1F (5’-GGGG TTTCTACTGGTGGT-3’) / amoA-2R (5’-CCCCT CKGSAAAGCCTTCTTC-3’ )[21]。每个样本3个重复,将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测, 使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物, Tris-HCl洗脱; 2%琼脂糖电泳检测; QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量。PCR反应体系为20 μL, 包括2×sybr MIX(with ROX) 10 μL, 0.2 μL的两种上、下游引物(10 μmol·L-1), 1 μL稀释8倍后的样品, 用RNase-Free ddH2O补足至20 μL。程序设置: 95 ℃5 min; 94 ℃30 s, 51 ℃30 s, 72 ℃50 s, 72 ℃10 min, 共35个循环, 琼脂糖凝胶电泳进行分析。

1.6 Illumina Miseq高通量测序

PCR产物回收后测定其浓度, 之后按照每个样本的测序量要求, 进行相应比例的混合, 使各处理用于测序的样品DNA浓度保持一致, 双末端测序采用Illumina Miseq测序平台进行, 本实验的测序工作委托上海美吉生物医药科技公司完成。

MiSeq测序得到的是双端序列数据, 首先根据PE reads之间的overlap关系, 将成对的reads拼接(merge)为一条序列, 同时对reads的质量和merge的效果进行质控过滤, 根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样品得到有效序列, 并校正序列方向, 即为优化数据。

1.7 数据处理

采用SPSS 22.0软件对数据进行方差分析。使用美吉生物云平台完成微生物多样性分析。

2 结果与分析

2.1 不同类型秸秆还田对稻田土壤理化性质的影响

在水稻抽穗期0—15 cm土层中(表1), 相比NS处理, 秸秆还田(RS和BS)处理降低了土壤全氮、硝态氮、铵态氮含量, 提高了土壤全碳和碳氮比, 差异不显著。其中RS处理的土壤全氮、全碳、硝态氮、铵态氮均高于BS处理, 而土壤pH值和碳氮比低于BS处理, 差异不显著。

表1 不同类型秸秆还田处理下稻田土壤理化性质

注: NS、RS和BS分别表示单施化肥、油菜秸秆+单施化肥和蚕豆秸秆+单施化肥处理。数据后不同小写字母表示各处理在5%水平差异显著。下同。

2.2 AOA和AOB群落核心物种分析

核心物种, 即共有物种, 是所有样本共有物种数目。根据核心物种曲线是否达到平缓, 可以评估本次测序样品量是否足够。由图1可知, 随着样本数量的增加, AOA(图1a)和AOB(图1b)在OTU水平的核心物种曲线趋于平缓。结果表明, 本研究测序样品量足以反映土壤样品AOA和AOB基因微生物信息。

2.3 AOA和AOB群落Alpha多样性分析

AOA和AOB群落Alpha多样性指数的单因素方差分析结果显示(表1), 3个处理之间AOA群落Alpha多样性指数没有明显变化。而各处理AOB群落的Ace指数、Chao指数和Sobs指数均表现为RS>BS>NS。结果表明, 不同类型秸秆还田对AOB群落多样性的影响强于AOA。对于AOB群落, 相比单施化肥, 秸秆还田(油菜和蚕豆秸秆)提高了其多样性。其中, 油菜秸秆还田的多样性高于蚕豆秸秆还田。

图1 AOA(a)和AOB(b)群落OTU水平核心物种数目

Figure 1 Numbers of shared OTU of AOA(a) and AOB(b) community

注: AOA和AOB分别表示氨氧化古菌和氨氧化细菌。下同。

表2 AOA和AOB群落Alpha多样性指数

注: 数据后不同小写字母表示各处理在5%水平差异显著。

2.4 AOA和AOB群落物种组成Veen分析

对AOA(图2a)和AOB(图2b)基因序列进行OTU水平Veen分析。3个处理共有39个相同的OTUs, 占AOA基因序列总OTUs的68.42%。相比NS处理, 秸秆还田(RS和BS)处理新出现9个OTUs, 占总OTUs的15.79%。其中RS处理独有5个OTUs, 占总OTUs的8.77%; BS处理独有3个OTUs, 占总OTUs的5.26%。

相比AOA , 不同类型秸秆还田条件下AOB基因序列OTUs分布差异较大。3个处理共有55个相同的OTUs, 占AOB基因序列总OTUs的8.79%。相比NS, 秸秆还田处理新出现397个OTUs, 占总OTUs的63.42%。其中RS处理独有228个OTUs, 占总OTUs的36.42%; BS处理独有131个OTUs, 占总OTUs的20.93%。结果表明, 相比AOA, 不同类型秸秆还田对AOB基因序列OTU数目和分布的影响较大, 但对AOB基因共有OTU数目的影响较小。相比单施化肥, 秸秆还田改变了AOA和AOB基因序列的OTU数目和分布, 增加了OTU水平的组成类群, 其中油菜秸秆还田对OTU分布的影响强于蚕豆秸秆还田。

图2 AOA(a)和AOB(b) amoA基因序列OTU水平Veen图

Figure 2 Veen drawing of AOA (a) and AOB (b)gene on OTU level

2.5 AOA和AOB在纲水平上群落组成分析

Heatmap图可使高丰度和低丰度的物种分块聚集, 通过颜色变化来反映不同分组在各分类学水平上群落组成的相似性和差异性。纲水平上, AOA(图3a)群落共由6个物种组成, 其中, environmental_ samples_p__Thaumarchaeota和unclassified_k__no­rank_d__Archaea为两个主要优势类群, 分别占AOA基因总序列的49.48%-51.76%和37.79%- 41.12%。NS、RS和BS处理中6个物种的相对丰度均没有显著差异(p>0.05)。

相比AOA, 不同类型秸秆还田对AOB群落结构的影响较大。纲水平上, AOB(图3b)群落共由6个物种组成, 其中,-变形菌纲(Betaproteobacteria)为主要优势类群, 占AOB基因总序列的95.20%—96.53%。处理RS中unclassified_p__ Proteobacteria的相对丰度比NS高2倍(<0.05), 比BS高1.45倍(>0.05)。NS、RS、BS处理中norank_p__ ammonia- oxidizing_bactera_ensemble的平均相对丰度分别是0.13%、0.02%、0。结果表明, 各处理之间AOA群落组成极为相似, 没有显著差异。但相比AOA, 各处理之间AOB群落组成差异较大。相比单施化肥, 油菜秸秆还田显著提高了AOB群落unclassified_ p__Proteobacteria的相对丰度, 减少了ammonia- oxidizing_bactera_ensemble的相对丰度; 而蚕豆秸秆还田缺失ammonia-oxidizing_bactera_ ensemble。

Figure 3 Heatmap of AOA (a) and AOB (b) community on class level

3 讨论

不同类型秸秆还田对AOB群落Alpha多样性指数的影响强于AOA。相比单施化肥, 秸秆还田(油菜、蚕豆秸秆)增加了土壤全碳含量, 提高了AOB群落的Alpha多样性指数。这与黄容等[14]部分研究结果一致。Sessitsch等[22]研究也发现土壤全碳含量越高, 微生物多样性越高。但本研究各处理之间的土壤理化性质、多样性指数的方差分析结果均无显著差异, 其原因可能是本试验年限短, 秸秆还田条件下土壤环境因子及其对土壤微生物多样性的影响有限。

Veen分析结果显示, 相比AOA, 秸秆还田对AOB基因序列OTU数目和分布的影响较大。这与碱性条件下土壤硝化作用主要由AOB主导的研究相一致[23-24]。且与单施化肥相比, 秸秆还田对AOA群落结构没有明显影响, 但显著改变了AOB群落结构, 这进一步证实了上述研究结果。研究表明, 在高pH、高浓度NH3土壤中, AOB比AOA具有更强的适应能力[25]。Prosser等[26]研究表明, 有机无机肥配施会增加土壤NH3含量, 且本试验土壤呈碱性。因此, 本研究AOB对秸秆还田的响应强于AOA。秸秆还田为土壤微生物提供了大量的碳源和能源, 但不同类型秸秆与养分释放、微生物活性之间存在密切关联[27]。因此, 不同类型秸秆还田对AOB群落组成的影响存在差异。相比蚕豆秸秆, 油菜秸秆还田能够释放更多的有机碳, 土壤微生物利用碳源的能力更强[28-29], 导致AOB群落微生物多样性增加, 群落结构显著变化。

对于AOB群落, 秸秆还田处理的ammonia- oxidizing_bactera_ensemble的相对丰度均低于单施化肥处理。这与杨亚东等[30]研究结果一致, 即相比单施化肥, 有机肥配施化肥能够降低硝化微生物ammonia-oxidizing_bactera_ensemble的相对丰度。蚕豆秸秆还田中缺失这一物种, 其原因可能是蚕豆作为豆科固氮作物, 提供的土壤氮素以一种更稳定的形式释放, 从而减少速效NH4+-N[31], 导致硝化微生物活性减弱。这与Paungfoo-Lonhienne等[32]研究结果一致, 即豆科作物能够抑制硝化微生物的作用, 减弱硝化强度。综上所述, 相比单施化肥, 秸秆还田具有抑制硝化微生物ammonia-oxidizing_bactera_ ensemble的作用, 从而减弱硝化强度。但蚕豆秸秆还田对这一微生物的影响强于油菜秸秆还田, 更具有减弱硝化强度的潜势。

4 结论

不同类型秸秆还田对AOB群落Alpha多样性指数的影响强于AOA。相比单施化肥, 秸秆还田(油菜和蚕豆秸秆)提高了AOB群落多样性指数, 其中油菜秸秆还田的多样性指数高于蚕豆秸秆还田。相比AOA, 秸秆还田对AOB基因序列OTU数目和分布的影响较大, 其中油菜秸秆还田对OTU分布的影响强于蚕豆秸秆还田。纲水平上, 不同处理之间AOA群落组成没有显著差异。但对于AOB群落, 相比单施化肥, 油菜秸秆还田显著提高了unclassified_ p__Proteobacteria的相对丰度, 减少了ammonia- oxidizing_bactera_ensemble的相对丰度; 而蚕豆秸秆还田缺失ammonia-oxidizing_bactera_ensemble。综上, 碱性潮土中AOB对不同类型秸秆还田的响应强于AOA, 是硝化作用的主要推动者。相比蚕豆秸秆还田, 油菜秸秆还田对AOB群落结构的影响更大。

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Effects of different types of straw returning on microbial community structure of ammonia oxidizers in paddy soil

GAO Zhenzhen1, WANG Rong2, GONG Songling1, ZHU Rong1, LIU Zhangyong1, JIN Tao1, *

1. College of Agriculture, Yangtze University, Jingzhou, Hubei 434025, China 2.Huanggang Academy of Agricultural Sciences, Huanggang, Hubei 438000, China

The purpose of this study was to investigate the effects of rape and broad bean straw returning on microbial community structure of ammonia oxidizers in paddy soil. Based on the alkaline soil of Jianghan Plainas the research object, the Illumina Miseq high-throughput sequencing platform was used to study the effects of different types of straw returning on the community diversity and structure of ammonia oxidizing archaea(AOA)and the ammonia oxidizing bacteria(AOB). Three treatments were compared, including conventional fertilization (NS), conventional fertilization plus rape straw (RS) and conventional fertilization plus broad bean straw (BS). The results showed that the effect of different types of straw returning on the Alpha diversity index of AOB community was stronger than that of AOA. For AOB community, compared with NS, straw returning (RS and BS) improved its diversity index, in which the diversity index of RS was higher than that of BS. Veen analysis showed that compared with AOA, the number and distribution of OTU in AOBgene sequence were significantly affected by different types of straw returning, in which the effect of RS was stronger than that of BS on OTU distribution. Different types of straw returning had no significant effect on the species composition and relative abundance of AOA community on class level (>0.05). While in AOB community, the relative abundance of unclassified_p__ Proteobacteria of RS was 2 times higher than that of NS (<0.05) and 1.45 times higher than that of BS (>0.05). Compared with NS, RS reduced the relative abundance of norank_p__ammonia-oxidizing_bactera_ensemble, BS missed this species. In conclusion, the response of AOB to different types of straw returning was stronger than that of AOA. Compared with BS, RS had a stronger effect on the microbial community structure of AOB.

rape straw; road bean straw; ammonia oxidizing archaea; ammonia oxidizing bacteria

10.14108/j.cnki.1008-8873.2020.04.009

高珍珍, 王蓉, 龚松玲, 等. 不同类型秸秆还田对稻田土壤氨氧化微生物群落结构的影响[J]. 生态科学, 2020, 39(4): 66–73.

GAO Zhenzhen, WANG Rong, GONG Songling, et al. Effects of different types of straw returning on microbial community structure of ammonia oxidizers in paddy soil[J]. Ecological Science, 2020, 39(4): 66–73.

S154

A

1008-8873(2020)04-066-08

2019-11-14;

2019-12-12

国家重点研发计划(2017YFD0800102; 2017YFD0301400)

高珍珍(1996—), 女, 山西吕梁人, 硕士研究生, 主要从事农业生态和土壤氮素循环研究, E-mail: 2274658281@qq.com

金涛, 男, 讲师, 主要从事农业生态与土壤氮循环研究, E-mail:jintao@yangtzeu.edu.cn