胶体金试纸条快速检测动物源性食品中头孢氨苄残留

刘敏轩，赵兴然，于璐，鹿浩志，王向红

（河北农业大学食品科技学院，河北保定071000）

头孢菌素类抗生素是7-氨基头孢烷酸（7-aminocephalosporanic acid，7-ACA）的衍生物[1-2]，多为有机酸性物质，头孢菌素类抗生素的杀菌作用较强，常被用来预防和治疗动物性疾病，并存在多种抗生素联用的现象，因而在动物源性食品中可能存在抗生素残留问题[3]。由于动物源性食品营养价值高，动物产品消费量巨大，动物源性食品中抗生素残留问题也日益受到人们的广泛关注[4-5]。头孢菌素类抗生素的滥用会造成其在畜产品中的残留，人类食用后会对人体产生过敏反应、胃肠道菌群失衡和细菌耐药性增强等不良影响[6-7]。因此，建立一种高效、便捷、快速的头孢菌素类抗生素多残留测定方法极为迫切。

目前，头孢菌素类抗生素残留的检测方法主要有微生物分析法、免疫分析法（immunoassay，IAS）、液相色谱法（liquid chromatography，LC）、液相色谱-质谱联用法（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）和电化学分析法等。微生物法[8]检测的时间较长、灵敏度低、操作人员要求高；高效液相色谱法（high perfor mance liquid chromatography，HPLC）[9-13]等仪器检测法程序复杂、成本较高，不利于现场大批量样品的测定；电化学分析法由于其稳定性欠佳，还没有普遍推广使用[14]。众多检测方法中，胶体金免疫层析技术[15-16]凭借其操作简单易行、分析时间短、检测效率高、结果可靠准确、适合样品大批量现场快速筛检等优势被广泛用于食品安全检测，应用前景广阔。

为了建立一种用于头孢菌素类抗生素残留测定的快速检测方法，本研究采用胶体金作为信号探针，基于免疫竞争原理，以硝酸纤维素膜（NC膜）为反应载体，以头孢氨苄（cefalexin，CEX）包被原（CEX-OVA）为检测线（T线），羊抗兔二抗为质控线（C线）开发了检测头孢菌素类抗生素的胶体金免疫层析试纸条，并成功通过样品的添加回收试验，验证了其实用性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

头孢氨苄抗血清：河北农业大学食品科技学院食品分析与营养实验室，采用谢会玲等[17]的方法制得；头孢氨苄（cefalexin，CEX）、头孢拉定（cefradine，RAD）、头孢羟氨苄（cefadroxil，CFR）、头孢哌酮（cefoperazone，CFP）、头孢唑啉钠（cefamezin，CZN）、头孢唑啉（cefazolin，CFZ）、头孢噻肟（cefotaxime sodium，CTX）、头孢呋辛（cefuroxim，CXM）：上海源叶科技有限公司（上海）；氯金酸、牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）、卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）、N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF）、N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxy succinimide，NHS）：Sigma公司（美国）；N，N’-二环己基碳二亚胺（dicyclohexylcarbodiimide，DCC）：阿拉丁化学有限公司（上海）；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、含吐温-20的磷酸盐缓冲液 （phosphate buffered saline with Tween 20，PBST）、硼酸缓冲液、羊抗兔IgG：北京索莱宝有限公司（北京）；NC膜：Millipore公司（美国）；样品垫、结合垫、吸水纸以及PVC底板：上海金标科技有限公司（上海）；待测样品：保定人人超市（保定）；其他化学试剂均为分析纯。

恒温磁力搅拌器（JB-2型）：上海一恒电子科技有限公司（上海）；恒温培养箱（DH5000Ⅱ）：上海精密试验设备有限公司（上海）；冷冻离心机（TDL-5）：上海Anke（上海）；半自动划膜仪XYZ3010：上海捷宁生物（上海）。

1.2 方法

1.2.1 CEX包被原的制备

合成步骤采用Matsuura等[18]的方法。称取20.00 mg CEX、13.25 mg NHS、26.11 mg DCC 溶于 1.40 mL DMF中，经涡旋混匀，于室温25℃孵育3h。取900μL反应液慢慢滴加到3 mL NaHCO3溶液中（浓度为0.10 mol/L，含有20.20 mg OVA），低温振荡反应2 h以上，置于4℃冰箱中反应过夜，得到包被原CEX-OVA。用紫外分光光度计法对偶联物CEX-OVA进行表征，在200 nm～500 nm的波长范围内对其进行扫描，通过组分特征峰推断偶联物是否制备成功。

1.2.2 胶体金的制备与表征

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金[19]。将1gHAuCl4配成1%的水溶液，于4℃避光存放，使用时再配制成0.01%的溶液。在磁力搅拌下，将0.01%HAuCl4水溶液加热至沸腾并保持3 min，迅速加入柠檬酸三钠溶液，待其变为透明的红色且保持不变时，煮沸5 min，撤去热源，搅拌15 min。自然冷却至室温25℃，加双蒸水至原体积，通过紫外扫描和透射电镜法对制备的胶体金进行表征。

1.2.3 金标抗体的制备

将纯化后的抗体蛋白用硼酸缓冲液进行稀释，磁力搅拌下，逐滴加入到10 mL胶体金溶液（pH=9.0）中，继续搅拌10 min，加入10%BSA至其终浓度为1%，继续搅拌30 min后4℃静置过夜。取出溶液于4℃低速离心除去沉淀，上清液于10 000 r/min低温离心30 min。去上清，用储存液将暗红色沉淀重悬，重复离心1次，重悬至1 mL，4℃放置。

1.2.4 标记CEX抗体蛋白条件的优化

将 100 μL 不同 pH 值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和10.0）的胶体金溶液置于酶标板中，每孔加入3 μg CEX抗体，混匀后于室温25℃放置15 min，每孔添加20 μL 10%NaCl溶液，混匀后于525 nm波长下测定OD值。

分别向1 mL的胶体金溶液中加入不同浓度的抗体（0.0、1.5、3.0、4.5、6.0、9.0、12.0、24.0、48.0 μg/mL），混匀后加入100 μL 10%NaCl溶液，反应1 h后于525 nm波长下测定OD值。

1.2.5 试纸条检测条件的优化

将二抗点样于NC膜上，分别用不同的封闭液（1%BSA、1%明胶、1%酪蛋白、5%脱脂乳和5%甘氨酸）在37℃条件下封闭30 min，取出后用PBST冲洗3次，干燥，滴加金标抗体进行显色，选择显色条带清晰且无背景色的封闭液。分别采用0.5、1.0、1.5 μg的CEXOVA为包被区，将金标抗体分别按1∶1、1∶5和1∶10体积比稀释后，取100 μL滴加到包被区，选择显色效果较好的浓度和稀释比例应用于试验。

1.2.6 样品前处理及添加回收验证

牛奶样品取全奶6 mL于离心管，4℃，9 000 r/min离心15 min，弃掉上层脂肪，取下层；牛肉、猪肉、虾肉样品，称取均质试样（1.0±0.001）g，按 1 ∶1（质量体积比）加入乙腈水溶液（8∶2，体积比），漩涡振荡，超声提取15 min，于室温（20℃～25℃）、3 500 r/min离心15 min，取上清液过0.45 μm有机滤膜备用。生猪肝、熟猪肝样品使用1∶3（质量体积比）乙腈水溶液（8∶2，体积比），4 000 r/min离心，取上清液过0.45 μm有机滤膜备用。向样品中添加一定浓度的标准品溶液进行添加回收试验。本试验通过HPLC方法对试纸条的准确性进行验证。

2 结果与讨论

2.1 紫外分光光度计法鉴定CEX-OVA的合成

抗原和胶体金的表征见图1。

图1 抗原和胶体金的表征Fig.1 Characterization of antigen and colloidal gold

图1a为CEX、OVA和CEX-OVA的紫外扫描图，可知CEX与载体OVA偶联后，其偶联产物CEX-OVA的吸收图谱分别具有CEX与OVA的特征吸收峰，O VA偶联CEX后蛋白质的特征峰形状和位置发生了变化，表现为各自迭加的性质，初步说明OVA分子上已经成功偶联CEX。

2.2 胶体金紫外扫描法和透射电镜法的鉴定结果

从光谱图1b可知，制得的胶体金溶液在525 nm处有最大吸收峰，由最大吸收波长λmax与胶体金颗粒的线性回归方程 Y（λmax）=0.427 1X（颗粒直径）+514.56[20]，可初步估算出金颗粒的直径约为24.4 nm，吸收峰峰宽为 149 nm。由式 Y（CV）=0.360 5X（峰宽）-53.549可得，直径变异系数CV为16.6%，表明溶液中金颗粒的粒径分布较均匀。

胶体金的透射电镜图1c、图1d所示，胶体金颗粒的大小基本一致，分散较均匀，没有多角形的颗粒存在，直径约为24 nm，与紫外扫描结果基本一致。

2.3 胶体金标记CEX抗体条件的确定

胶体金标记CEX抗体条件的确定试验参数优化结果见图2。

图2 试验参数优化结果Fig.2 Optimization of the experimental parameters

图2a为不同pH值条件下金标抗体OD值的变化，随着体系pH值的升高，金标抗体的OD值不断升高，当pH值达到9.0时，金标抗体的OD值达到最高，然后趋于稳定并逐渐减小，说明当体系pH值达到9.0时，金纳米颗粒与抗体二者结合最为稳定。故标记抗体蛋白的溶液pH值选9.0。由图2b可知，当抗体蛋白用量小于9 μg时，吸光值随着抗体蛋白用量的增加而增大，当抗体蛋白用量大于9 μg时，吸光度值趋于平衡。表明抗体蛋白用量为9 μg时与胶体金结合最佳。

2.4 封闭液的优化

为了降低NC膜的非特异性吸附，需要用封闭液对膜上未结合的位点进行封闭，结果如表1。

表1 试纸条的封闭结果Table 1 The blocking results of the strips

未进行封闭处理、经5%甘氨酸、经1%BSA封闭处理的NC膜背景色较深，降低了检测线与背景的反差，影响结果的判断；经1%酪蛋白封闭处理的NC膜背景色较浅，条带显色较清晰；而经1%明胶和5%脱脂乳封闭处理的NC膜背景色较浅，条带颜色鲜明，容易判断结果。经5%脱脂乳封闭的NC膜条带显色最鲜明，封闭效果最为理想，且脱脂乳廉价易得。因此本试验试纸条封闭液采用5%的脱脂乳。

2.5 CEX-OVA包被量和金标抗体稀释度的确定

CEX-OVA包被量和金标抗体稀释度与试纸条的显色结果直接相关，结果如表2。

表2 金标抗体稀释度和包被原CEX-OVA包被量的优化Table 2 Optimization of the dilution fold of the gold-labeled antibodies and coated antigen CEX-OVA

当包被0.5 μg的CEX-OVA时，T线处结合的金标抗体比较少，显色较浅；包被量为1.5 μg时，T线的显色偏深，1.0 μg与1.5 μg的显色效果基本相同。当金标抗体的稀释度在1∶5时，3个包被量的试纸条显色情况均较好。因此选择包被1.0 μg的包被原，金标抗体的稀释度为1∶5。

2.6 二抗稀释倍数的优化

将二抗进行稀释作为C线，取金标抗体稀释液100 μL滴加到包被区显色，优化结果见图3。

图3 酶标二抗的稀释倍数的优化结果Fig.3 Result of HRP antibody conjugates for different dilution fold

由图3可知，随着二抗稀释倍数的加大，C线的显色越来越浅。当稀释倍数为20时，NC膜上C线的显色较T线深，不利于测定结果的判断；稀释倍数为40时，C线的显色与T线相当，易于进行结果的判断；当稀释倍数为80、160、320时，NC膜上C线的显色明显浅于T线，基本不可见，影响试纸条的有效性。所以，二抗的最佳稀释倍数为40倍。

2.7 CEX检出限的确定

将制备的胶体金试纸条对CEX的检测限进行测定，结果如图4所示。

图4 CEX胶体金试纸条检出限的确定Fig.4 The detection limit of colloidal gold strips for CEX

随着CEX浓度的依次增大，T线的颜色越来越浅，当CEX的浓度小于20 μg/L时，T线颜色明显肉眼可见，与空白溶液不能由目测法进行区分；当其浓度等于或大于20 μg/L，T带显色较浅甚至消失，能通过目测将两者分开，因此该试纸条对于CEX的检出限为20 μg/L。

2.8 胶体金试纸条特异性的检测

在最优检测条件下，所制试纸条对头孢菌素类抗生素的检测灵敏度差异较大，用同样的方法检测其他7种头孢类抗生素，结果如图5所示。

图5 其他7种头孢菌素类抗生素的试纸条检测结果Fig.5 Test strip test results of 7 other cephalosporin antibiotics

该试纸条对CFP、CZN、CFZ、CTX和CXM的特异性不明显，对这几种头孢菌素类抗生素无交叉反应，但对CEX、RAD、CFR的灵敏度较高，即交叉反应率高，可进一步研究多残留检测。由显色结果可判断7种抗生素的检测限，如表3所示。

表3 CEX和其他7种头孢菌素类抗生素的检测限Table 3 Detection limits for CEX and seven other cephalosporin antibiotics

2.9 待测物的添加回收试验和HPLC方法验证

虾肉提取液进行20倍稀释，牛奶、牛肉、猪肉提取液进行40倍稀释，生猪肝、熟猪肝提取液进行80倍稀释后，用试纸条检测，条带显色清晰且无背景色，显色效果与对照接近，即基质影响基本消除。6种样品的加标提取液经过基质消除后，用试纸条测定，低检出限为 20 μg/L，结果如表 4。

表4 6种样品的CEX添加回收检测结果Table 4 The determination results of CEX in six samples

用HPLC法与试纸条（n=3）进行测定，结果如表5所示。

表5 样品中不同CEX添加水平的HPLC与试纸条测定结果比较Table 5 CEX of results obtained by HPLC and strips at three spiked level

续表5 样品中不同CEX添加水平的HPLC与试纸条测定结果比较Continue table 5 CEX of results obtained by HPLC and strips at three spiked level

所建立试纸条法与HPLC法在检测范围内有很好的相关性，即试纸条法准确可靠，可用于实际样品的测定。

3 讨论

本文建立了快速检测动物源性食品中CEX残留量的胶体金标记免疫分析方法。通过对试纸条检测条件优化，对CEX检测限为20 μg/L，经过样品提取液校正后其检测限为20 μg/L，整个检测过程仅需10 min，实现了对CEX的快速检测。用HPLC法对试纸条的可靠性进行评估，结果表明两者一致性较好，即试纸条法的测定结果准确可靠。适用于实际动物源性食品中头孢菌素类抗生素样品的现场快速筛查。成功建立可检测头孢类抗生素残留胶体金免疫层析试纸条。