生菜叶片完整性对金黄色葡萄球菌生长的影响

瞿 洋，白亚龙，林 婷，索玉娟，周昌艳

(上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所，上海市农产品质量安全评价专业技术服务平台，上海农产品质量安全工程技术研究中心，上海201403)

瞿洋，白亚龙，林婷，等.生菜叶片完整性对金黄色葡萄球菌生长的影响[J].上海农业学报，2020，36(4)：89-93

食源性致病菌在自然界分布广泛，可通过多种途径污染生鲜蔬果，国外已发生多起食用生鲜蔬果引起的食源性疫情。 例如，2011 年美国18 个州因食用被单增李斯特菌污染的哈密瓜暴发食源性疫情，导致146 人患病30 人死亡；2016 年美国因黄瓜暴发沙门氏菌疫情，导致至少907 人感染，其中6 人死亡，204人住院；2018 年美国32 个州因生菜污染大肠杆菌O157：H7 暴发疫情，导致172 人食物中毒[1-2]。 随着人们对饮食营养要求的提高及生活节奏的加快，越来越多的人选择无需加工或微加工的新鲜蔬果制品，这类食品一旦被致病菌污染，将对人体健康造成隐患。

金黄色葡萄球菌可产生耐热的肠毒素，其引起的食物中毒潜伏期一般较短(1—6 h)，常见的症状包括干呕、恶心、呕吐、咳嗽、腹痛、腹泻、胸痛。 患者体温大多略高，有些病例有发热、出汗、头晕、头痛、血压的变化等症状，严重的病例可能出现中毒、休克[3-4]]。 无论在发达国家还是在发展中国家，由该菌引起的食物中毒病例在细菌性食物中毒中均占较大比例。 在我国，20%—25%的细菌性食物中毒病例由金黄色葡萄球菌引起，它是仅次于沙门氏菌和副溶血性弧菌的第三大致病菌[5]。 生菜是我国种植和消费较多的一类即食叶菜，虽然我国还没有出现因食用生菜而发生大规模疫情的安全事件，但国内研究者发现绿叶菜中金黄色葡萄球菌的污染率为16.3%(53∕325)，国外也有报道称金黄色葡萄球菌为即食生菜中的主要食源性致病菌[6-8]。 为预防金黄色葡萄球菌食物中毒，欧美等国已将食品安全关注点从食源性疾病暴发的事后调查转移至食品污染的早期评估[2]。

针对金黄色葡萄球菌，国内外已先后开展了其在肉制品、米面制品和乳制品中的风险评估研究[9-11]，而在即食果蔬中的研究尚不完善。 关于生菜，国内外主要开展了鲜切生菜中的预测微生物模型的建立[12-20]，尚无完整生菜叶片中食源性致病菌的相关研究。 考虑到生菜中金黄色葡萄球菌的高污染率，本研究从影响细菌生长的两大因素：温度和介质状态为切入点，探究这两大因素对生菜上金黄色葡萄球菌生长的影响，提出生菜安全收、贮、运与消费的建议，为该菌在生菜中消长动力学模型的构建与定量风险评估研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2017 年7—10 月于上海市奉贤区金汇镇超市和农贸市场采集生菜；金黄色葡萄球菌于2017 年上半年自生菜中分离保存(按照GB 4789.10—2010 进行分离鉴定；PCR 检测该菌的特异基因nuc，证实其为金黄色葡萄球菌)。

Baird-Parker 培养基(BP)、磷酸盐缓冲液(PBS)购于北京陆桥技术有限责任公司；胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)、脑心浸液肉汤(BHI)、琼脂粉、利福平购于上海博蕴生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

高压灭菌锅(TOMY，SX-500)；生物安全柜(Thermo scientific，1300 series A2)；恒温培养箱(上海精宏设备有限公司，DNP-9272 型)；恒温振荡培养箱(上海精宏实验设备有限公司，TQZ-312 型)；电子天平(Mettler Toledo，AL104)；均质仪(漯河市金田实验设备研究所，JT-B∕JT-C 匀浆仪)；漩涡混匀仪(Vortex Genie，Scientific Industries)。

1.3 方法

1.3.1 菌株利福平抗性诱导

利福平诱导浓度见表1。 用无菌接种环蘸取适量甘油冷冻管中的金黄色葡萄球菌分离株，在固体BHI平板上划线分离，于37 ℃恒温培养箱中倒置，培养过夜。 用无菌接种环挑取单菌落，接种于BHI 液体培养基中进行活化，置于37 ℃恒温摇床中，过夜培养。 将活化的金黄色葡萄球菌分离株按照1∶100 接种于含BHI液体培养基(含低浓度利福平)中，置于37 ℃恒温摇床中过夜培养至稳定期，将有低浓度利福平抗性的金黄色葡萄球菌按照1∶100 接种于含BHI 液体培养基(含高浓度利福平)中，置于37 ℃恒温摇床中过夜培养至稳定期，如此递进，将耐受120 mg∕L 的金黄色葡萄球菌划线接种于含120 mg∕L 浓度利福平的BHI 平板上，于37 ℃恒温培养箱中倒置培养过夜，用甘油管冷冻保存该菌株。 最终，金黄色葡萄球菌生菜分离株由最初的5 mg∕L耐受浓度被诱导为120 mg∕L 的耐受浓度。 为减小浓度误差，本研究最终选用100 mg∕L 的利福平为目的菌的筛选浓度。 在该浓度下的BP 平板上，生菜叶上的背景菌均无明显生长。

表1 利福平诱导金黄色葡萄球菌的浓度Table 1 The concentration of rifampicin induced S.aureus

1.3.2 菌悬液的制备

无菌条件下挑取利福平抗性的金黄色葡萄球菌单菌落于BHI(含100 mg∕L 利福平)中过夜培养至稳定期，取该稳定期新鲜菌液1 ml 于9 ml PBS 中，混匀，10 倍梯度稀释至104CFU∕mL，备用。

1.3.3 样品制备

选取市场新鲜生菜样品，去除外层叶片后，摘取约10 g 完整叶片置于均质袋中备用；鲜切生菜样品为4 cm×4 cm 大小，每份约10 g，置于均质袋中备用。

1.3.4 接种

取1.3.2 中制备的菌悬液100 μl，按照点植法[21]涂抹于叶片上，风干后将均质袋封口，置于培养箱中培养。

1.3.5 生长曲线测定

将1.3.4 中的样品分别置于25 ℃和37 ℃恒温培养箱培养，每隔一段时间，取出样品，无菌条件下向均质袋中加入100 ml PBS，均质2 min；吸取1 ml 均质液，按梯度进行稀释，吸取100 μL 稀释液，涂布于含有利福平的BP 平板，置于37 ℃培养箱培养，进行菌落计数(有效计数范围为30—300)。 每个温度设置两组平行试验，以不接目的菌的生菜样品为空白对照，生菜自身所带细菌在该平板上均不生长。

1.3.6 微生物生长模型的建立

金黄色葡萄球菌在鲜切生菜中生长数据采用修正No Lag Phase Growth 模型拟合，模型表达式如下：

其中，t：培养时间，h；Y(t)：t时的微生物数量，lg CFU∕g；Y0：初始微生物数量，lg CFU∕g；Ymax：最大菌落数，lg CFU∕g；μmax：微生物生长速率，lg CFU∕g∕h 。

1.3.7 模型的拟合指标

RMSE(residual standard error)是残差分析法的一个重要指标，可以评价数据的变化程度，RMSE 的值越小，说明预测模型精确度越好。 通常RMSE ＜0.5 lg CFU∕g，为试验误差的正常范围[22]。

式中，n为试验数据总数；p为模型中参数的个数。

式中，yi为第i时的实测值；^yi是第i时的预测值。

1.3.8 数据处理

采用Excel 2010 软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 金黄色葡萄球菌在完整叶片上的生长状况

从图1 可知，25 ℃培养时，金黄色葡萄球菌的菌落数在3.61 lg CFU∕g—3.88 lg CFU∕g，金黄色葡萄球菌生长值小于0.50 lg CFU∕g；37 ℃培养时，金黄色葡萄球菌的菌落数在2.92 lg CFU∕g—3.59 lg CFU∕g，金黄色葡萄球菌生长值小于0.70 lg CFU∕g。 表明，无论是在25 ℃还是在37 ℃下培养，金黄色葡萄球菌在完整生菜叶片上的增殖能力均小于1.00 lg CFU∕g。 同时，金黄色葡萄球菌在完整生菜叶片中的生长曲线无法呈现“S”型，即便测定值偏差较大，总体趋势也更偏向于直线，表明该菌在完整生菜叶片上无明显增殖，同时不能使用预测微生物学模型进行拟合。

2.2 金黄色葡萄球菌在鲜切叶片上的生长状况

从表2 可知，金黄色葡萄球菌在鲜切生菜中的生长曲线RMSE 值均小于0.5 lg CFU∕g，能较好地与No Lag Phase Growth 模型拟合。 图2(A)显示，25 ℃下金黄色葡萄球菌初始接菌量为3.03 lg CFU∕g 时，经过84 h 培养，金黄色葡萄球菌的生长值大于1.00 lg CFU∕g，最大菌落数为4.08 lg CFU∕g；图2(B)显示，37 ℃时，金黄色葡萄球菌的的初始接菌量为2.99 lg CFU∕g，同时，随着时间延长，金黄色葡萄球菌的生长值和最大菌落数变大，分别为2.51 lg CFU∕g 和5.50 lg CFU∕g。

此外，金黄色葡萄球菌在鲜切生菜中的生长速率(μmax)和最大菌落数与温度有紧密联系。 当温度升高时，金黄色葡萄球菌的生长速率会变大，当温度为25 ℃时，金黄色葡萄球菌的生长速率为0.06 lg CFU∕(g·h)，生长较缓慢；当温度为37 ℃时，生长速率为0.35 lg CFU∕(g·h)，远高于25 ℃时的生长速率(表2)。

表2 鲜切生菜中金黄色葡萄球菌在不同温度下的生长参数Table 2 The growth value of S.aureus on intact lettuce leaves

3 结论与讨论

本研究针对生菜中污染率较高的金黄色葡萄球菌，比较了其在完整生菜叶片和鲜切叶片两种状态中的生长状况，发现金黄色葡萄球菌在室温(25 ℃)和适温(37 ℃)下，分别培养84 h 和48 h，在完整叶片上均无明显增殖，而在鲜切叶片上有明显长势，适温下最高可长至5.50 lg CFU∕g。

生菜叶片上的背景微生物对致病菌的生长可能会产生促进或抑制作用[24]，为了描述实际环境中金黄色葡萄球菌在生菜上的生长状况，本研究未对采集的生菜样品进行清洗和消毒处理，而是利用带有抗性的目的菌进行生长测定，更客观地分析金黄色葡萄球菌在有背景微生物存在下的生长状况。 生菜等鲜食农产品与其他食品材质相比，其研究的难点在于材质的非均一性与叶片自身携带微生物的复杂性。 生菜叶脉、气孔密度、叶片表面疏水性及可溶性蛋白均会导致细菌在叶片上的黏附差异[23]。 本研究选取了超市及农贸市场的罗马生菜及奶油生菜样品进行比较，结果显示即便在细菌适宜的生长温度37 ℃下，金黄色葡萄球菌在完整的叶片上也不会增殖。

金黄色葡萄球菌食物中毒主要是由其产生的肠毒素引起，以往多是研究食物中的菌浓度，而很少有食物中具体的肠毒素含量检测数据。 一般认为食物中金黄色葡萄球菌含量达到105CFU∕g 即可产生毒素，因此，105CFU∕g 这个浓度值被认为是导致食物中毒的最小浓度[25-27]。 鲜切生菜叶片上，切割造成的机械损伤使得叶片营养物质外流，导致微生物侵染生菜内部组织进而生存繁殖[28]。 本研究中，室温下金黄色葡萄球菌虽有增殖，但仅增长了一个对数值，达104CFU∕g，小于105CFU∕g 的产毒理论浓度，而适温下(37 ℃)，金黄色葡萄球菌经9 h 增殖，可增长至105CFU∕g，表明鲜切生菜叶片在高温下可以达到理论上诱发肠毒素产生的浓度，这也与已有研究认为温度是影响致病菌在叶片上生长的重要因素一致[29]。

该研究探讨了生菜叶片完整性对金黄色葡萄球菌生长的影响，认为在细菌适宜的生长温度下，保持叶片的完整性对抑制金黄色葡萄球菌的生长极其重要，建议今后生菜中金黄色葡萄球菌的定量风险评估研究其相关预测微生物学模型的构建应重点在鲜切叶片中，生菜收、贮、运及选购过程中应尽量避免叶片的损伤与交叉污染的发生，夏季加工鲜切生菜后应及时食用或放于冰箱低温保存。