高迁移率族蛋白1 与心脏疾病的研究进展

肖湖南，刘宏斌，蔡雨伦

解放军总医院第二医学中心 心血管内科，北京 100853

高迁移率族蛋白1(high mobility group box protein 1，HMGB1)是一种非组蛋白核蛋白。研究发现HMGB1 不仅在细胞核中具有稳定DNA 及调节转录等功能[1]，还可以作为内源性炎性因子参与多种生理病理过程，对多种疾病的发生及发展有着关键的调控作用。由于HMGB1 所在位置的不同以及所处环境的不同，其发挥的作用也不同。本文就HMGB1 的结构、介导的信号通路、与多种心脏疾病的关系等方面进行回顾，旨在阐述HMGB1的功能及其在心脏疾病中的生物学效应。

1 HMGB1 的结构及生物学功能

HMGB 家 族 蛋 白 是 由HMGB1、HMGB2、HMGB3、HMGB4 组成并存在于哺乳动物中的一组核蛋白家族，在细胞核中与DNA 结合，参与DNA的重组、修复、基因转录调控、细胞复制及分化成熟等生命活动[1]。HMGB1 具有重要的生理学功能，HMGB1 基因敲除小鼠出生后多于24 h 内死亡。随着研究的不断深入，对HMGB1 功能的认识越来越深入。

HMGB1 序列高度保守，几乎存在于所有真核细胞的细胞核中。人HMGB1 蛋白由215 个氨基酸构成，并形成三个结构域：A-Box、B-Box 以及一个由30 个氨基酸构成的C 尾端。HMGB1 有两个核定位信号(NLS1 和NLS2)和两个核出口信号(NESs)，提示该蛋白在细胞核和细胞质之间可以自由穿梭，正常情况下HMGB1 主要存在细胞核中[1]。HMGB1 蛋白在A-Box 的C23、C45 位置及B-Box 的C106 位置存在3 个保守半胱氨酸，这3 个氨基酸易发生氧化从而影响HMGB1 的生物学功能。3 个保守半胱氨酸的HMGB1 为还原态HMGB1(fully reduced HMGB1；fr-HMGB1)，C23、C45 位置的半胱氨酸被氧化后形成二硫键，成为二硫化HMGB1(disulfide HMGB1；ds-HMGB1)；C106位置的半胱氨酸进一步氧化后形成氧化态的磺酰HMGB1(sulfonyl HMGB1；ox-HMGB1)[2-3]。脂多糖刺激单核细胞分泌的HMGB1 主要为fr-HMGB1 和ds-HMGB1[3]。在小鼠肌肉损伤的模型中，坏死肌肉细胞释放的HMGB1 均为还原态的fr-HMGB1，但由于细胞外的氧化条件，很快转变为二硫化的ds-HMGB1[3]。最终ds-HMGB1 将转化为ox-HMGB1。不同状态的fr-HMGB1 和ds-HMGB1 所发挥的生物学效应基本相反。fr-HMGB1 主要表现为趋化、增殖作用，诱导巨噬细胞分化为具有促进修复功能的表型[3-4]。ds-HMGB1 具有刺激细胞分泌细胞炎性因子及趋化因子，促进内皮细胞生成血管，从而促进炎症反应[2,5]。HMGB1 还有一种突变体，C23、C45、C106 位置的半胱氨酸被丝氨酸替代，形成3S-HMGB1，具有与fr-HMGB1 类似的功能，这种突变体不被氧化为ds-HMGB1[2]。ox-HMGB1 主要存在炎症的后期，主要与损伤/修复相关，同时可能与中性粒细胞的活化状态有一定关系[6]。

HMGB1 的生物学功能不仅与氧化还原状态相关，还与结合的不同受体相关。其主要的受体有晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products，RAGE)、Toll 样 受 体2(toll like receptors，TLR2)、TLR4、CXCR4、CD2 等[7]。几乎所有形态的HMGB1都可以与RAGE受体结合，但ds-HMGB1 对其具有最高的亲和力[8]。HMGB1与RAGE 受体结合，可激活分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK) 及 核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)等多条通路，增加趋化因子SDF-1、TNF-α、IL-1β、IL-6 等因子的分泌，促进细胞迁移、细胞增殖、组织增生、炎症、自噬、新陈代谢的功能[9-10]。TLRs 是参与非特异性免疫的重要蛋白质分子，同时也是连接非特异性免疫与特异性免疫的桥梁。HMGB1 与TLR2 及TLR4 结 合 后 可 引 起NF-κB的活化，从而激活中性粒细胞及巨噬细胞的炎症反应[11]。HMGB1/TLR2 可以促进NK 细胞及肿瘤干细胞的活化。已经发现HMGB1 与TLR2、TLR4介导的炎症反应在肺、肝损伤、肿瘤、癫痫及心脏疾病中发挥了重要作用[12-14]。ds-HMGB1 通过与CD14 及TLR4 配体MD-2 结合后与TLR4 结合，促进炎症反应[15]。CXCR4 受体激活后主要促进白细胞趋化因子SDF-1 的表达[16]。fr-HMGB1 可以与SDF-1 形成复合物，可以稳定SDF-1，避免其被降解，激活成纤维细胞、树突状细胞、巨噬细胞等的移行[17]。fr-HMGB1 还可以通过CXCR4 受体促进有利于组织愈合的巨噬细胞迁移及干细胞的增生、分化，从达到肌肉、造血细胞、肝组织的再生及修复的目的[2,4]。因此HMGB1 的生物学效应十分丰富，参与了众多的病理生理学活动，在疾病的发生发展中可能起着关节的调节作用。

2 HMGB1 与心脏疾病

目前，HMGB1 在冠心病、缺血再灌注损伤、心衰等心脏疾病中均有不少的研究，HMGB1 的生物学活性同一些炎性因子类似，在急性心肌梗死的急性损伤中，HMGB1 主要由细胞坏死释放，主要为fr-HMGB1[2-3]，作为损伤相关的分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)， 激活炎症通路，促进梗死区域的炎症反应，改善组织修复，同时还可以通过减少心肌细胞凋亡及促进自噬改善心肌存活，从而改善心功能；但在再灌注损伤及动脉粥样硬化等疾病中，HMGB1 更多地被氧化为ds-HMGB1，不同于急性心梗，其激活的炎症通路不同，导致疾病进展恶化。其可能的机制是不同的疾病状态，HMGB1 的浓度、HMGB1的氧化还原状态以及其激活的炎症通路不同。

2.1 心肌梗死 心肌梗死是心肌缺血后心肌细胞发生坏死的结果。心肌一旦发生坏死，将释放大量DAMPs，并诱发急性炎症反应。炎症细胞快速清除坏死物质，并分泌生长因子，激活成纤维细胞、内皮细胞进行组织的修复与重塑。最后，炎症细胞逐渐减少，炎症逐渐消退，组织修复。HMGB1 在心梗发生的时候由坏死细胞大量释放，作为DAMPs，激活炎症反应，促进组织修复[18]。在小鼠心梗模型中，检测到心梗后血清中HMGB1的水平明显升高。心梗后的几天，梗死区域的HMGB1 达到巅峰水平。在心梗急性期，HMGB1主要分布于浸润的炎症细胞，心梗后期存在于纤维组织中[19]。在心梗后阻断细胞外HMGB1，可以加重心梗导致的心功能不全。在心梗后24 h 注射HMGB1 抗体，可以观察到炎症反应的减轻及瘢痕组织变薄[19]。而促进小鼠HMGB1 的表达，可以减轻心梗后的梗死面积，心功能影响更小，存活率更高。HMGB1 还可以促进梗死区域的新生血管形成及干细胞的迁移[20]。研究还发现，HMGB1 可通过激活腺苷酸激活蛋白激酶途径及抑制雷帕霉素受体复合物途径减少心肌细胞的凋亡及促进细胞自噬改善心肌存活。最新的研究提示TLR9 受体可能是HMGB1 促进心梗后心肌修复的关键受体[21]。fr-HMGB1 可以明确改善内皮细胞的迁移、干细胞的分化以及心肌细胞收缩。但HMGB1 对心肌梗死的改善依赖于氧化还原环境，通过注射变异不会氧化的3S-HMGB1，将导致心梗恶化、增加胶原蛋白沉积等[17]。HMGB1 同样可以改善心梗后心肌重塑及心肌纤维化，从而改善心功能[22]。

多项研究发现，急性心肌梗死后，循环中HMGB1 水平明显升高。2006 年Goldstein 等[23]最早发现急性心梗患者血清中的HMGB1 水平相比于正常人明显升高。随后的研究发现，发病后12 h HMGB1 水平到达顶峰，并将持续增高7 d，而且HMGB1 的最高水平与心梗后的泵衰竭、心脏破裂、住院死亡发生率以及C 反应蛋白水平相关[19]。HMGB1 的升高在心肌损伤中的特异性不高，炎症性疾病均可不同程度地导致HMGB1 的升高，因此HMGB1 作为心梗的生物标志物潜力有限。但心梗后HMGB1 的水平与心梗患者的预后可能相关，具有成为心梗患者预后风险预测指标的潜力。研究发现心梗后HMGB1 的水平与心梗6 个月后的脑利钠肽水平呈正相关[19]。ST 段抬高型心肌梗死患者入院后3 h 的HMGB1 水平与心梗后3 ～ 4 周的左心室射血分数、心率恢复以及死亡率相关[24]。一项日本的研究通过对不稳定型心绞痛及非ST 段抬高型心肌梗死患者进行了49 个月的中位随访，发现在症状出现的24 h 内HMGB1 水平与不良心血管事件呈明显正相关[25]。研究发现，HMGB1 较C 反应蛋白能更好地反映心梗患者的预后，因此HMGB1 具有成为危险分层指标的潜力，但仍需进一步大规模的随机对照研究进行论证。

2.2 缺血再灌注损伤 当心肌梗死患者开通梗死相关血管后，梗死区域的血流灌注恢复，导致大量白细胞聚集及大量自由基产生，从而引起更为严重的损伤，称为缺血再灌注损伤损伤[26]。在动物试验中发现HMGB1 在缺血再灌注损伤模型中的水平明显升高。细胞外的HMGB1 可以通过TLR2、TLR4 激活JNK 通路、NF-κB 通路从而加重缺血再灌注损伤[14]。HMGB1 还可以通过RAGE 受体中心粒细胞进入受损心肌，加重缺血再灌注损伤[27]。缺血再灌注损伤中的氧自由基可能是HMGB1 发

挥作用的重要因素，通过清除氧化自由基，可以显著减少损伤区域HMGB1 的表达，并减轻再灌注损伤的程度。不同于上述对心肌梗死的积极作用，在再灌注损伤中，HMGB1 表现出的是消极的作用，多种抑制HMGB1 表达的物质均可改善再灌注损伤[28-29]，其可能的机制是再灌注损伤后产生大量的氧自由基，导致fr-HMGB1 大量被氧化为ds-HMGB1，从而导致损伤加重。因此HMGB1 在缺血再灌注中发挥的作用比较复杂，推测可能与HMGB1 受缺血再灌注时氧化还原环境的急剧变化有关，具体仍需进一步研究证实。

2.3 心衰 心脏疾病的终末期均可出现不同程度的心衰。目前研究发现，炎症在心衰的发生和发展中起了关键作用。在心衰人群中，HMGB1 的血清学水平明显升高，且与左心室射血分数呈反比关系[30]。进一步研究发现，对心衰患者进行19 个月的随访，发现HMGB1 升高的患者不良心血管事件发生率更高[31]。在缺血性心脏病所致心衰的患者中，HMGB1 水平明显升高，且其水平与NT-proBNP 水平、MYHA 心功能分级呈正相关，与左心室射血分数呈负相关；在12 个月的随访中发现，死亡组患者的HMGB1 水平明显高于存活组[32]。这些研究提示HMGB1 可能与心衰患者的预后密切相关，有成为心衰患者生物学标志物的潜力。

2.4 动脉粥样硬化 动脉粥样硬化是冠心病、脑血管疾病、外周血管病等多种疾病的共同发病机制之一。动脉脉粥样硬化的发生发展与内皮细胞损伤、单核巨噬细胞黏附聚集、脂质沉积、平滑肌细胞迁移增生、活化的血小板以及细胞因子等密切相关。在动脉粥样硬化斑块组织及相关细胞中，HMGB1 的表达显著升高[33-34]。体外实验证实，HMGB1 可以通过RAGE 受体促进内皮细胞及平滑肌细胞表达更多的黏附因子、趋化因子、血管活性物质、基质金属蛋白酶[35]。Kanellakis 等[35]利用HMGB1 抗体作用于动脉粥样硬化模型小鼠，降低了斑块负荷，减少了斑块内免疫细胞的数量。我们的研究证实，使用HMGB1 抑制剂丙酮酸乙酯抑制HMGB1 表达后减弱了斑块大小并降低了斑块内炎症，同时发现斑块内TLR2 及TLR4 的表达同时下降，提示TLR2 及TLR4 在HMGB1 促进斑块内炎症反应过程中可能存在介导作用[34]。考虑到HMGB1 的多种氧化还原状态以及斑块内的氧化自由基增加等环境变化，HMGB1 在动脉粥样硬化中的具体生物学效应尚不明确，有待进一步研究揭示。HMGB1 也可能成为动脉粥样硬化的干预靶点。

2.5 心肌炎 心肌炎通常是由病毒、细菌等感染后诱发的自身免疫性炎症反应[36]。CD4+T 淋巴细胞介导的心肌炎小鼠模型证实，HMGB1 水平明显升高，而抗HMGB1 抗体可以显著减少Th17 细胞、降低炎性因子水平并减少心肌纤维化[37]。进一步研究发现HMGB1 与Th17 细胞的增殖、分化密切相关[38]。近年新的小鼠心肌炎模型也发现阻断HMGB1 可以减少心肌炎的炎症反应及心脏功能障碍[39]。心肌炎目前暂无特异性治疗，HMGB1 的在其中的生物学效应使其可能成为治疗的靶点。

2.6 糖尿病心肌病 大量的临床研究证实，糖尿病与冠心病、心衰等心脏疾病密切相关。高血糖可以引起心肌细胞肥大、凋亡、间质纤维化，并导致心肌的收缩功能障碍[40]。体外实验证实，高糖可以通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶通路促进心肌细胞、巨噬细胞分泌HMGB1[41]。抑制HMGB1 或RAGE 受体可以改善链脲霉素诱导的糖尿病小鼠模型的心肌纤维化、炎症及功能障碍。同时HMGB1 还通过细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)通路调控Caspase-3 和凋亡基因Bax 的活性从而调控心肌细胞的凋亡[42]。HMGB1 可以直接通过丝裂原活化蛋白激酶途径直接调节心肌成纤维细胞的增殖及活性[42]，也可通过TLR4 降低抗纤维化因子IL-33 从而促进心肌纤维化[43]。白藜芦醇的抗氧化作用可降低糖尿病心肌的HMGB1 表达，并改善糖尿病心肌的功能和损伤[44]。这些研究提示HMGB1 与糖尿病心肌病的心肌纤维化、心肌重塑、心肌凋亡及胶原沉积等密切相关。

3 总结

HMGB1 在体内细胞中广泛表达，正常情况下，主要参与DNA 复制及转录。当发生组织损伤及炎症反应时，HMGB1 可以通过主动释放或坏死细胞释放到细胞外，与多种受体相互作用，发挥了重要的生物学功能。HMGB1 在疾病的不同时期、不同氧化状态表现出了不同的生物学效应。fr-HMGB1与ds-HMGB1 可受环境的氧化还原状态影响互相转化，而ox-HMGB1 状态则不可逆。在很多疾病的病理生理过程中，HMGB1 不同的状态可能发挥了完全不同的作用。在急性心肌梗死中，HMGB1促进了炎症反应，改善组织修复，减轻了心肌损伤。而在心肌炎、动脉粥样硬化、糖尿病心肌病等慢性疾病中，炎症的作用往往是促进疾病的进展，而抑制HMGB1 通常能取得改善效应，其在不同疾病中显示不同作用的机制可能与HMGB1 的氧化还原态有关，但HMGB1 的氧化还原态可以实时自由转换，检测难度高，同时机体的氧化还原环境也时刻发生变化，因此相关研究开展存在困难。考虑到HMGB1 的氧化状态不一致可以带来不同的作用，单纯抑制或增加HMGB1 可能并不是唯一的研究方向，通过调节HMGB1 的氧化还原状态，可能也是未来的研究方向。