幽门螺杆菌感染患儿血清外泌体蛋白组分差异探讨

尧战勇 张亮 许春娣 傅睿,4（通讯作者）

（1 南昌大学江西医学院 江西 南昌 330006）

（2 上海交通大学医学院附属瑞金医院北院儿内科 上海 201801）

（3 上海交通大学医学院附属瑞金医院儿内科 上海 200025）

（4 江西省儿童医院肾内科 江西 南昌 330006）

现知全世界约一半人群感染了幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)，且我国也有42%～90%高感染率[1]。研究已证明，Hp 作为致病因子，不仅与胃炎、消化性溃疡、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤乃至胃癌的发生密切相关，还是引起包括心脑血管、血液系统、呼吸系统、肝胆、皮肤、营养代谢及自身免疫病等胃肠道以外疾病的重要因素[2]。近年来研究发现，外泌体是一种由多种细胞分泌的，直径为30 ～150nm，电镜下呈球状或杯状，来源于细胞内吞途径中的多泡小体。外泌体富含母细胞成分，通过传递蛋白质、脂类和核苷酸在细胞通讯中发挥重要作用。在正常和病理状态下，外泌体广泛分布于外周血、尿液、唾液、腹水、羊水等体液中[3]。我们提取Hp 感染患儿血清外泌体，并通过蛋白质组学分析外泌体中的蛋白组分，为Hp 感染作为致病因子所致相关疾病的发病机制的研究提供思路。

1.资料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 标本来源及分组 选取2017 年2 月—2018 年2 月因反复恶心呕吐、反酸、嗳气、腹胀、上腹部疼痛等上消化道症状来上海交通大学医学院附属瑞金医院及瑞金北院儿内科就诊的慢性胃炎患儿，随机选取3 例确诊为Hp 感染儿童，同期选取3 例健康体检儿童，分别设为实验组和对照组，年龄（6 ～37）岁，均经监护人知情同意并签订知情同意书。实验经瑞金医院伦理委员会同意，符合医学伦理学标准。

幽门螺杆菌感染阳性判断标准，同时具备以下两点：①胃黏膜组织病理学检查和快速尿素酶试验阳性；②13C 尿素呼气试验。

1.1.2 外泌体提取 应用美国101Bio 的试剂盒PureExo® Exosome Isolation Kit(for serum or plasma)从血清中提取外泌体，经电镜和粒径分析，获得直径为30 ～150nm 的小囊泡，证明提取的外泌体合格。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白提取和还原烷基化处理 每个样品取适量进行提取实验；向其中加入蛋白裂解液，混匀后冰上孵育5min，加入终浓度10mM 的DTT，冰浴超声15min，然后13000g，4℃离心20min，取上清转入新的离心管中；向离心管中加入4 倍体积的冷丙酮，在-20℃静置过夜。离心收集蛋白沉淀，空气中晾干。加入8M urea/100mM TEAB(pH8.0)溶液重新溶解蛋白，加入DTT至终浓度10mM，56℃水浴30min 进行还原反应。随后加入IAM 至终浓度55mM，暗处室温放置30min 进行烷基化反应。Bradford 法测定蛋白浓度。

1.2.2 酶解和除盐 将来自每个样品的等量的蛋白质用于胰蛋白酶消化。取100μg 的蛋白质用于胰蛋白酶消化。用100mM TEAB 将蛋白溶液稀释5 倍后，按1：50 的质量比例（胰酶：蛋白）加入胰蛋白酶，37℃酶解过夜。酶解后的肽段用C18 柱脱盐，真空冷冻干燥脱盐后的肽段。

1.2.3 液相色谱-质谱联用分析 质谱数据采集使用的是TripleTOF 5600 +液质联用系统（SCIEX）。将多肽样品溶解于2%乙腈/0.1%甲酸中，并使用与Eksigent nanoLC 系统（SCIEX，USA）偶联的TripleTOF 5600plus 质谱仪进行分析。将多肽溶液加到C18 捕获柱（5μm，100μm×20mm）上，并以120min 时间梯度，300nL/min 的流速在C18 分析柱（3μm，75μm×150mm）上进行梯度洗脱。 两个流动相是缓冲液A（2%乙腈/0.1%甲酸/98%H2O）和缓冲液B（98%乙腈/0.1%甲酸/2%H2O）。对于IDA（信息依赖性采集），以250ms的离子累积时间进行一级质谱图的扫描，并以50ms 的离子累积时间采集40 个前体离子的二级质谱图。在350 ～1500m/z 的范围内采集MS1 光谱，并且在100 ～1500m/z的范围内采集MS2 光谱。将前体离子动态排除时间设置为15s。

1.3 信息分析流程

1.3.1 原始质谱数据 选用swiss-prot 数据库的Homo sapiens 序列+污染库序列，共包含20213 条蛋白序列。

1.3.2 蛋白质的鉴定及定量 鉴定结果的过滤标准为肽段可信度＞=95%，鉴定的蛋白至少包含一个独特的肽段。通过Skyline 软件对蛋白质进行定量分析，对检测到的190 个蛋白进行定量分析，共39 个差异蛋白。

1.3.3 差异蛋白功能分析 采用STRING 软件中functional protein association networks 进行生物功能和疾病分析。

2.结果

2.1 幽门螺杆菌检测

实验组3 例患儿均为上消化道内镜病理检查和13C 呼气试验双阳性确诊。对照组3 例健康体检儿童均为血清Hp 抗体及13C呼气试验阴性。

2.2 血清来源的外泌体的鉴定

微泡直径大小在30 ～150nm 之间，呈杯状凹陷，与公认的外泌体形态一致。

2.3 血清来源的外泌体的蛋白组分分析

在外泌体蛋白中，有190 个蛋白是与数据库重合的，其中39 个蛋白是实验组和对照组的差异蛋白，其中上调蛋白19 个，下调蛋白数20 个，其中P最小最显著差异的蛋白、结合珠蛋白(Haptoglobin,HPT)，对氧磷酶1(Paraoxonase-1,PON1)、纤维连接蛋白(Fibronectin1,FN1)（表1）。显著差异蛋白的筛选标准为，差异倍数|FC|≥1.5，P＜0.05。

表1 血清来源外泌体所含的差异蛋白比值P 最小前10 个蛋白

2.4 血清外泌体的功能分析

血清来源的外泌体蛋白参与疾病和功能过程，其中参与对脂质过氧化反应、应激反应、急性炎症反应、蛋白水解调节、内吞作用、防御反应等的功能蛋白在Hp 感染患儿血清外泌体中表达显著高于健康对照组(图1)。

图1 Hp 患儿血清来源的外泌体所含蛋白相关的前10 个功能

3.讨论

绝大部分成人Hp 感染是发生在儿童年幼阶段，Hp 感染后在胃黏膜上皮细胞定植，通过中性粒细胞、巨噬细胞、T 淋巴细胞和B 淋巴细胞诱导胃黏膜浸润，这种免疫和炎症反应自身难以清除[4]，使宿主容易出现慢性炎症[5]引起并发症，并持续到成年后期。Hp 感染可能通过改变血脂、增强LDL 氧化、激活炎症反应参与冠状动脉粥样硬化[6]。一项荟萃分析显示，抗幽门螺杆菌IgG 阳性与动脉粥样硬化和小动脉疾病引起的缺血性中风(IS)风险密切相关，尤其是对于非心源性栓塞性IS[7]。台湾学者对台湾民众健康保险研究资料库的大数据分析提示根除H p 与冠心病呈正相关[8]。有学者利用已发表的前瞻性队列研究确定H p 和冠心病之间的关系，在19 项队列研究中的13 项研究中观察到Hp 慢性感染对主要冠心病事件的风险影响增加[9]。Hp 感染是否为心血管疾病危险因素一直存在争议，Hp 感染后如何致动脉粥样硬化的发生机制仍有待进一步探讨。

近年来，对于外泌体的相关研究倍受关注，外泌体不仅在调控正常生理过程如组织修复、维持干细胞稳态、免疫监视和血液凝固等中发挥重要作用，而且参与许多疾病的病理生理过程。通过对H p 患儿及对照组血清来源的外泌体质谱分析共检测到190 个蛋白，有显著差异蛋白39 个，P最小最有显著差异的蛋白为对氧磷酶1(Paraoxonase-1,PON1)、纤维连接蛋白(Fibronectin1,FN1)、结合珠蛋白(Haptoglobin,HPT)，其中PON1 为下调蛋白，我们将其列为研究对象之一。PON1 能够水解多种有机磷底物和内酯，以及多种芳香羧酸酯，介导低密度脂蛋白酶的保护作用，防止氧化修饰和由此引起的一系列导致动脉粥样硬化形成，参与HDL的抗氧化功能，具有动脉粥样硬化保护作用，推测P O N1 在预防细菌感染中的作用可能与HDLs 在先天免疫中的作用有关[10]。第一篇报道Hp 感染患者的对氧化酶和芳香酯酶活性的论文实验观察到Hp 感染阳性组HDL-c 水平显著低于Hp 感染阴性组，而LDL-c 水平显著高于阴性组[11]。Hp 可诱导长期存在的低级别持续性炎症刺激[5]，PON1 活性可能在炎症过程中降低[12]。血清PON1 活性降低可能与HDL-C 的降低有关，部分与H p 感染引起的氧化应激和炎症反应有关[11]。在一项前瞻性的临床研究中表明，PON1 活性的降低是冠心病的独立危险因素[13]。本研究首次发现在H p 感染的患儿血清外泌体中下调蛋白PON1，Hp 感染后通过什么因子调控PO N1 对降低动脉粥样硬化以及保护心脏的确切机制仍有待详细阐明，然而我们的这项研究有一些潜在的局限性，样本量很小，所以需要在更大的人群中进行进一步的研究。

综上所述，本研究对比Hp 感染与健康儿童血清外泌体蛋白表达差异，提示Hp 感染可能通过刺激机体慢性持续低度炎症反应，改变炎症细胞外泌体组成成分（如PO N1），影响机体健康状况，如心血管疾病风险，具体靶点细胞及相关信号通路有待进一步研究。