不同方法构建大鼠实验性牙周炎模型的实验研究

林珊 戴丽冰（通讯作者） 翁春辉 赵向阳 郭爱芳

（1 广州市红十字会医院＜暨南大学医学院附属广州红十字会医院 广州市创伤外科研究所＞ 广东 广州 510220）

（2 广东燕岭医院口腔科 广东 广州 510507）

（3 广州市红十字会医院口腔科＜暨南大学医学院附属广州红十字会医院口腔科＞ 广东 广州 510220）

牙周炎属于非常普遍的慢性免疫炎症性疾病，导致牙龈组织、牙周韧带和邻近的支持性牙槽骨逐渐丧失[1-2]。动物模型有助于研究牙周炎的发病机制及临床表现的。目前猴子、狗、兔、鼠等动物是目前最主要的造模动物，但大型动物造模受实验条件和社会伦理问题的限制，在大多数情况下使用大鼠模型成为牙周病研究的一个方向[3-4]。革兰氏阴性细菌在牙周炎中属于较为重要的致病菌，而脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）属于这类细菌重要组成部分，是内源性免疫反应的重要刺激物[5-6]。因此，一个简单、可复制的大鼠牙周病模型，为人类牙周病的发病机制及防治研究有积极的意义。大鼠通常用于实验模型，因为磨牙的牙周解剖区与人类有一些相似之处[7-8]。本实验以斯泼累格·多雷（SD）大鼠为研究对象，参照诸多学者的牙周炎动物模型构造方法，探讨出一种快速构建大鼠牙周炎动物模型的有效方式。

1.资料与方法

1.1 实验动物、器械

SD 大鼠24 只，雌雄均一半，SPF 级，体重(198.95±45.85)g，采购于南方医科大学,10%水合氯醛（上海国药集团，生产批号30037517）；乙醇（上海国药集团，生产批号801769722）；大肠杆菌O 111：B4 株脂多糖（E-LPS） 购自美国Sigma 公司，批号L-2630；正畸结扎丝（上海康桥齿科医械厂，生产批号：120305）；牙周探针（上海康桥，ALLQX0700）；汉密尔顿注射器10μL。实验动物许可证证照编号：SYXK(鄂)2018-0042，均符合动物伦理学认可。

1.2 实验方法

将24 只大鼠随机分成3 组：健康对照组、LPS 注射组、正畸结扎丝组，均8 只。均使用10%水合氯醛(0.3ml/100g,腹腔注射) 麻醉, 对照组无需任何干预。正畸结扎丝组：正畸结扎丝大鼠在双侧上颌第一磨牙置于龈下，在颊侧打结并滴注LPS 2μl。LPS 注射组在显微镜下，于大鼠上颌第一、第二磨牙之间腭侧牙龈注射2μ l。L P S 注射每2 天1 次，持续2 周。注射过程中没有观察到组织炎症或软组织损伤明显的迹象。处置结束等待苏醒，从实验日喂食常规鼠料和水，记录3 组动物活动状态、饮 食、体重、粪便情况，记录口腔糜烂及牙周袋形成，记录其不同之处。在术后1、4 周断颈处死各组中的3 只大鼠，均取大鼠双侧上颌骨，截取5mm×5mm 标本，及时进行处理。将标本制成颊舌向5μ m 厚的组织切片，苏木素- 伊红(H E) 染色，记录牙周组织情况。

1.3 观察指标

牙龈出血指数(Sulcus bleeding index，SBI)SBI 评定标准采用Mazza（1981）提出的0 ～5 分记分法，0 为牙龈健康；1 为牙龈轻度水肿，探诊不出血；2 为仅在探诊出呈状出血[9-10]；3 为出血沿龈缘扩展；4 为出血溢出龈缘；5 有自发出血倾向或溃疡形成[11]。牙周探诊深度(probing depth，PD)用探针轻探实验牙的牙周袋，2 每个实验牙各测量颊侧、腭侧两个位点测量，取平均[12-13]。

1.4 统计学方法

2.结果

2.1 临床表现

2.1.1 术后1 周 正畸结扎丝组大鼠双侧上颌第一磨牙的结扎线有3 只脱落,牙龈呈粉红色，不出血，与对照组无差异；剩下5 只大鼠结扎丝未脱落，其牙龈稍红肿，探诊不出血。LPS 注射组牙龈向冠方肿胀，未出血。

2.1.2 术后4 周 对照组与1 周时已脱落的结扎丝组，牙龈均为粉红色，弹性较好；5 只结扎丝未脱落大鼠牙龈暗红色，探诊袋内壁有出血。LPS 注射组牙龈边缘圆钝，与牙面未出现贴附，腭侧龈缘黏膜糜烂、坏死，探诊后牙龈出血，牙龈退缩达釉牙骨质界以下，牙龈糜烂、牙根面暴露，牙齿I°松动 ，见图1-3。

图1-3 三组大鼠口内变化情况

2.2 组织病理学改变

2.2.1 术后1 周 对照组、3 只结扎丝脱落及5 只结扎丝未脱落的正畸结扎丝组的大鼠牙龈结合上皮为无角化的鳞状上皮，牙槽骨表面光滑，未出现骨陷窝及破骨细胞。LPS 注射组大鼠牙龈结合上皮钉突增生，纤维结缔组织出现水肿，牙槽骨并未出现变化。

图4-5 大鼠病理学变化

2.2.2 术后4 周 对照组、3 只结扎丝脱落大鼠的病理变化与对照组之间并无差别。5 只结扎丝未脱落的正畸结扎丝组大鼠，与LPS 注射组大鼠，在牙龈组织中结合上皮向根方增殖、延伸，龈沟壁处出现炎症，牙周膜胶原变性、降解，但牙周膜间隙宽度增加，牙槽骨出现破坏。牙龈结合上皮出现加深，出现较深的牙周袋，发生炎症细胞。

2.3 三组间SBI 及PD 值比较

正畸结扎丝组和LPS 注射组干预1、4 周后的SBI 和PD 高于对照组，LPS 注射组干预1、4 周后的SBI 和PD 高于正畸结扎丝组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；三组大鼠干预4 周后的SBI 和PD 高于同期干预1 周后，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 三组大鼠牙周探诊深度比较（±s，mm）

表1 三组大鼠牙周探诊深度比较（±s，mm）

注：③与②、①同期各项比较，P ＜0.05；①与②同期比较，P ＜0.05；本组干预4 周后与1 周时比较，P ＜0.05。

n SBI PD 1 周 4 周 1 周 4 周正畸结扎丝组① 8 0.9±0.58 1.9±0.61 0.36±0.03 1.31±0.20 LPS 注射组② 8 1.6±0.52 3.6±0.52 0.87±0.02 1.54±0.30对照组③ 8 0.3±0.23 0.6±0.78 0.11±0.11 0.13±0.05

3.讨论

牙周炎主要是炎性破坏疾病，患者会合并出现出血、肿胀，包括牙槽骨吸收，形成牙周袋，最后患者牙齿出现脱落与松动[14]。牙菌斑是牙周炎的始动因子，牙菌斑可通过脂多糖促进骨吸收，而重要细菌为革兰阴性细菌，成为免疫反应重要刺激物[15]。

通过建立牙周炎动物模型，记录牙周炎病因情况，对致病因子产生良好条件。大鼠属于啮齿动物，其牙周情况与人类较为相似，能够作为良好的实验工具，牙周组织与人基本一致，且大鼠价格较为便宜，实验成活率较高，有利于在实验中进行[16]。

关于实验性牙周炎动物模型建立的方法，早期国内外均有报道。目前主要实施多种方法的联合应用，缩短实验性牙周炎动物模型建立所需的时间，建立符合实验要求的模型标本。柴巧学等[17]、刘红等[18]报道采用结扎法均能成功诱导动物牙周病的发生。王瑢等[19]研究表明单纯注射LPS 于大鼠磨牙的牙龈组织，最早在注射7d 后就能发现牙槽骨丧失。本次实验结果发现：LPS注射组的大鼠分别在1、4 周时表现出牙周炎的发展的连续过程，1 周时是牙周病早期牙龈炎的表现，是一个急性渗出性炎症反应；4 周时，牙龈出现重度急性炎症反应，牙龈上皮红肿，并能够观察到明显的溃疡情况，上皮下结缔组织可见大量淋巴细胞浸润，胶原变性、破坏，牙槽骨破坏明显，可见死骨形成，属于典型的急性重度牙周炎活动期的病理表现。

正畸结扎丝组大鼠在2 周时有3 只大鼠结扎线脱落，仅形成牙龈炎的表现，可能是由于大鼠进食的食物较粗糙，结扎期间出现脱落，最终难以形成牙周炎的模型。

本研究采用LPS 注射大鼠上颌磨牙和使用正畸结扎丝结扎法均可成功构建实验性牙周炎动物模型，操作方法简单，可重复性好。但结扎丝法有可能因结扎丝脱落而失败，而注射法在成功建模的同时并且可以缩短建模需要的时间，而且注射部位、剂量等易于控制，缺点在于需要使用微量注射器和较细的针头并需要在放大镜下操作[20]，增加了实验成本。

综上所述，建立以上两种牙周炎模型均可成功建模，但局部注射LPS 方法制备牙周炎动物模型更佳。