COX-2、HPV16-E6蛋白在宫颈癌组织中的表达及意义

赵健 林军 周燕

[摘要] 目的 分析研究環氧合酶-2（COX-2）、人乳头瘤病毒16型E6蛋白（HPV16-E6）在宫颈癌组织中的表达与病理特征间的关系。 方法 选取2017年11月～2019年11月46例初诊宫颈癌患者和46例因妇科良性疾病手术或门诊治疗的患者作为研究对象，采用S-P法对COX-2、HPV16-E6蛋白在宫颈癌组织中的阳性表达进行检测，采用阳性细胞百分比和染色强弱对指标进行评分。 结果 病理参数中年龄、病理类型、组织学分级、临床分期和肿瘤直径的COX-2阳性表达差异无统计学意义（P>0.05），肌层浸润深度、宫旁或脉管浸润、淋巴结是否转移的COX-2阳性表达差异有统计学意义（P<0.05）;病理参数中组织学分级、临床分期、淋巴结是否转移、肿瘤直径和肌层浸润深度的HPV16-E6蛋白阳性表达差异无统计学意义（P>0.05），而年龄、病理类型、宫旁或脉管浸润高度的HPV16-E6蛋白阳性表达差异有统计学意义（P<0.05）;COX-2与HPV16-E6蛋白在宫颈癌组织中表达呈显著正相关关系，在宫颈慢性炎症组织中表达呈显著正相关关系。 结论 COX-2与HPV16-E6蛋白在宫颈癌侵袭、转移过程中可发挥协同作用。

[关键词] 宫颈癌;COX-2;HPV16-E6;表达;病理类型;组织学分级

[中图分类号] R737.33          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2020）18-0135-04

Expression and significance of COX-2 and HPV16-E6 proteins in the tissues of cervical cancer

ZHAO Jian1   LIN Jun1   ZHOU Yan2

1.Department of Pathology， Quzhou People's Hospital in Zhejiang Province， Quzhou   324000， China; 2.Department of Gynaecology， Quzhou People's Hospital in Zhejiang Province， Quzhou   324000， China

[Abstract] Objective To analyze and study the relationships between the expression of cyclooxygenase-2（COX-2） and human papillomavirus type 16 E6 protein（HPV16-E6） in cervical cancer tissues and their pathological characteristics. Methods From November 2017 to November 2019， 46 patients with newly diagnosed cervical cancer and 46 patients undergoing surgery or outpatient treatment for benign gynecological diseases were selected as the study subjects. The positive expressions of COX-2 and HPV16-E6 proteins in cervical cancer tissues were detected by the S-P method， and the indices were scored using the percentage of positive cells and the intensity of staining. Results There was no statistically significant difference in the positive expression of COX-2 in age， pathological type， histological grade， clinical stage and tumor diameter in pathological parameters（P>0.05），the difference between the positive expression of COX-2 and the depth of muscular invasion， parauterine or vascular invasion， and lymph node metastasis were statistically significant（P<0.05）. There was no statistically significant difference in the positive expression of HPV16-E6 protein in histological grade， clinical stage， lymph node metastasis， tumor diameter， and muscular infiltration depth（P>0.05）. The difference in the positive expression of HPV16-E6 protein of age， pathological type， parauterine or vascular infiltration height was statistically significant（P<0.05）. There was a significant positive correlation between the expressions of COX-2 and HPV16-E6 proteins in cervical cancer tissues， and there was a significant positive correlation in cervical inflammatory tissues. Conclusion COX-2 and HPV16-E6 proteins can play a synergistic role in the invasion and metastasis of cervical cancer.

[Key words] Cervical cancer; COX-2; HPV16-E6; Expression; Pathological types; Histological grade

宫颈癌是一种临床较为常见的恶性肿瘤，我国女性宫颈癌的发病率在恶性肿瘤中居首位，也是导致女性死亡的重要原因，对女性的健康产生严重威胁[1-2]。女性发生宫颈病变后，随着病情发展会导致上皮内瘤变和宫颈癌，这期间的癌前病变和宫颈癌是可以预防和治疗的，但关键是早期诊断。有研究指出，人乳头瘤病毒（HPV），尤其是高危型HPV感染是导致宫颈癌和癌前病变的重要原因，若未受到该病毒感染则不会发生宫颈鳞癌[3-4]。人乳头瘤病毒16型E6蛋白（HPV16-E6）失控和过表达在宫颈癌发病的过程中起到了重要作用[5-6]。但是大多数HPV感染在2年时间内可以被清除，因此，不可忽视其他因子在宫颈癌发病中的协同作用。环氧合酶-2（COX-2）是一种与多种肿瘤发生和发展关系密切的酶，主要是通过抑制细胞凋亡、促进细胞黏附和移动、增加肿瘤细胞侵袭转移能力以及促进生成新生血管等机制发挥致癌的作用[7-9]。基于此，本文分析研究了COX-2、HPV16-E6蛋白在宫颈癌组织中的表达与病理特征间的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年11月～2019年11月在我院接受治疗的46例宫颈癌患者，平均年龄（43.26±5.62）岁。其中腺癌、鳞癌、腺鳞癌和透明细胞癌分别为6例、36例、4例，根据FIGO标准将患者分为Ⅰ期26例、Ⅱ期18例和Ⅲ期2例，根据组织分化程度将患者分为G1 13例、G2 20例和G3 13例，年龄：45岁以下26例、45岁及以上20例;淋巴结有转移22例、无转移24例;肿瘤直径：4 cm以下33例、4 cm及以上13例;有宫旁或脉管浸润20例、无宫旁或脉管浸润26例;浅肌层25例、深肌层21例。46例患者在本院治疗前均未接受过放疗和化疗治疗。此外，选择由于妇科良性疾病在本院接受治疗的同期46例患者，其中，宫颈组织正常患者22例、宫颈慢性炎症患者14例、宫颈上皮内瘤变患者10例，所有患者的病历资料完整。

1.2 方法[10]

1.2.1 病理参数  COX-2和HPV16-E6蛋白相关病理参数均包括年龄、病理类型、组织学分级、临床分期、淋巴结是否转移、肿瘤直径、宫旁或脉管浸润、肌层浸润深度。

1.2.2 实验试剂  本实验所用试剂有：鼠抗人HPV16-E6单克隆抗体、羊抗人COX-2多克隆抗体、DAB显色试剂盒和S-P试剂盒、即用型羊S-P kate检测试剂和即用型鼠S-P kate检测试剂。

1.2.3 检测方法  本研究采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶联结免疫组化（S-P）法对COX-2、HPV16-E6蛋白在宫颈癌组织中的阳性表达进行检测。该检测方法主要是将生物素标记的第二抗体、链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶与基质素相混合，利用此混合液测定细胞、组织中抗原。具体步骤为：将组织芯片于室温放置60 min，再用二甲苯浸泡20 min;无水乙醇水化2 min;PBS冲洗3次，每次5 min;80%甲醇孵育10 min，保证灭活内源性过氧化物酶活性;PBS冲洗3次，每次5 min;置0.01 mol/L枸橼酸缓冲液中95℃ 20 min，自然冷却30 min;PBS冲洗3次，每次5 min;低价正常血清封闭液，室温孵育20 min;滴加50 μL Ⅰ抗，室温静置1 h;PBS冲洗3次，每次5 min;滴加40 μL Ⅱ抗，室温静置1 h;PBS冲洗3次，每次5 min;滴加SP，室温孵育30 min;DAB显色10 min，显微镜下掌握染色程度;自来是冲洗10 min终止反應;复染2 min，盐酸酒精分化;自来是冲洗10 min;常规脱水、透明、封片和镜检。本实验在操作过程中严格按照S-P染色试剂盒相关说明进行。

1.3 免疫组化结果判断标准[11]

1.3.1 评分标准  采用阳性细胞百分比和染色强弱对指标进行评分，评分公式为：IHS=a×b。a和b分别代表阳性细胞百分比和阳性细胞染色强弱。当a取值为0时，为无阳性细胞;当a取值为1时，为阳性细胞介于1%～10%;当a为2时，代表阳性细胞介于11%～50%;当a为3时，则阳性细胞介于51%～80%;当a为4时，则阳性细胞超过80%。当b为0时，则为阴性;当b为1时，则为弱阳性;当b为2时，则为中度阳性;当b为3时，则为强阳性。用（-）、（+）、（++）、（+++）分别对应评分结果0分、1～4分、5～8分、9～12分。

1.3.2 阳性判定标准  胞浆内出现棕黄色颗粒即为COX-2阳性细胞，而HPV16-E6蛋白阳性细胞则是根据细胞内出现棕黄色颗粒来判定，同时胞浆中也会出现部分。利用IHS评价所有切片，统计得分。以上所有批次的染色同时设立对照，同时一抗选择PBS液代替，为阴性空白对照。

1.4 统计学方法

采用SPSS18.0统计学软件对研究涉及数据资料进行处理，并采用Spearman等级相关法对数据进行统计分析;计量资料以（x±s）表示，采用t检验;计数资料用[n（%）]表示，采用χ2检验;P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 COX-2的阳性率以及与病理参数关系

参数中的年龄、病理类型、组织学分级、临床分期和肿瘤直径COX-2阳性表达差异无统计学意义，而肌层浸润深度、宫旁或脉管浸润和淋巴结是否转移COX-2阳性表达差异有统计学意义。见表1。

2.2 HPV16-E6蛋白与相关参数关系

研究表明，病理参数中组织学分级、临床分期、淋巴结是否转移、肿瘤直径和肌层浸润深度的HPV16-E6蛋白阳性表达差异无统计学意义，年龄、病理类型、宫旁或脉管浸润高度的HPV16-E6蛋白阳性表达差异有统计学意义。见表2。

2.3 COX-2与HPV16-E6蛋白的相关性

研究显示，COX-2与HPV16-E6蛋白有正相关关系。见表3。

2.4 COX-2与HPV16-E6蛋白在宫颈慢性炎症组织中表达的相关性

研究显示，COX-2与HPV16-E6蛋白在宫颈慢性炎症组织中表达呈显著正相关关系。见表4。

3 讨论

人乳头瘤病毒是无包膜的DNA病毒，属于乳多空病毒科，其种属的特异性和嗜上皮性较为严格[12]。研究者在1972年首次提出人乳头瘤病毒感染可引发宫颈癌。目前，已有众多研究结果证实人乳头瘤病毒感染可以诱发多种恶性肿瘤，这其中就包括宫颈癌[13-14]。本研究结果显示，病理参数中组织学分级、临床分期、淋巴结是否转移、肿瘤直径和肌层浸润深度的HPV16-E6蛋白阳性表达差异无统计学意义，年龄、病理类型、宫旁或脉管浸润高度的HPV16-E6蛋白阳性表达差异有统计学意义。有研究指出，年龄40岁以上人群是人乳头瘤病毒高危型的主要感染对象，基本上不可能自然缓解，且与宫颈癌之间具有密切的关系[15-16]。本研究结果与以上研究的结论完全一致。有研究指出，宫颈腺癌主要与HPV18相关，宫颈鳞癌主要是由HPV16感染所致[17-18]，这与本研究结果显示的HPV16-E6蛋白在鳞癌中的表达较高，而在腺癌、腺鳞癌和透明细胞癌中的表达较低相一致。近年来，有研究者指出，HPV16-E6蛋白发生变异具有宫颈癌患病的风险[19]。HPV16-E6蛋白可以一定程度上激活端粒酶，也是转化为宫颈癌的一个非常重要的步骤，随着宫颈癌病情的进展其阳性表达率会随着不断升高，两者之间呈现出显著的正相关[20]。还有研究表明，宫颈癌的发生和发展对血管具有明显的依赖，VEGF-C可以在多种肿瘤细胞中表达，可以诱导生成淋巴管和血管，从而促进肿瘤的侵袭[21]。

COX-2只有在较少的组织中表达，但是当受到炎症性因子、细胞因子和内毒素等刺激时，其表达可快速增加，甚至会超过50倍。有研究者指出，COX-2在口腔黏膜白斑、肠道息肉和宫颈黏膜等癌前病变以及食管癌、胃癌、乳腺癌、皮肤癌等多种恶性肿瘤中的表达明显增加[4]。COX-2在肿瘤细胞内的表达水平与肿瘤组织的血管内皮生长因子-C mRNA含量呈显著正相关。有研究者对COX-2 mRNA相对含量与子宫内膜癌的生物学关系进行了研究，结果显示，COX-2 mRNA在子宫内膜癌深肌层浸润中的含量较为明显升高，这可以在一定程度上说明COX-2 与肿瘤细胞的浸润具有一定的关系[5]。本研究结果也显示，参数中肌层浸润深度、宫旁或脉管浸润和淋巴结是否转移的COX-2阳性表达差异有统计学意义，这与以上结果相一致。

本研究结果表明，病理参数中的年龄、病理类型、组织学分级、临床分期和肿瘤直径的COX-2阳性表达差异无统计学意义，肌层浸润深度、宫旁或脉管浸润、淋巴结是否转移的COX-2阳性表达差异有统计学意义;病理参数中的组织学分级、临床分期、淋巴结是否转移、肿瘤直径和肌层浸润深度的HPV16-E6蛋白阳性表达差异无统计学意义，而年龄、病理类型、宫旁或脉管浸润高度的HPV16-E6蛋白阳性表达差异有统计学意义;COX-2与HPV16-E6蛋白在宫颈癌组织中表达呈显著正相关关系，在宫颈慢性炎症组织中表达呈显著正相关关系。

综上所述，COX-2与HPV16-E6蛋白在宫颈癌侵袭、转移过程中可发挥协同作用。

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（收稿日期：2020-04-27）