脑脊液环介导等温扩增和GeneXpert MTB/RIF在结核性脑膜炎早期诊断中的效能分析
2020-08-21樊丽超陈宇朱雅娟曹宏丽
樊丽超 陈宇 朱雅娟 曹宏丽
[摘要] 目的 分析和比較脑脊液环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）和GeneXpert MTB/RIF（简称GeneXpert）在结核性脑膜炎早期诊断中的效能。 方法 选取沈阳市胸科医院2018年6月～2019年6月疑诊结核性脑膜炎的患者189例，采集患者抗结核治疗前的脑脊液标本分别进行液体培养（MGIT）、LAMP和GeneXpert检测。以液体培养法（MGIT）为标准，计算2种检测技术在结核性脑膜炎诊断中的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、一致率、Kappa值。 结果 LAMP的敏感度为79.6%，特异度为94.3%，阳性预测值为83.0%，阴性预测值93.0%，一致率90.5%，Kappa值=0.749。GeneXpert的敏感度为98.0%，特异度为88.6%，阳性预测值为75.0%，阴性预测值为99.2%，一致率为91.0%，Kappa值=0.787。 结论 LAMP和GeneXpert对结核性脑膜炎检测的灵敏度较液体培养（MGIT）明显提高，可以在一定程度上提高临床医生对疑似结核性脑膜炎患者的诊治能力，值得在基层结核病院实验室广泛推广。
[关键词] 结核性脑膜炎;脑脊液;环介导等温扩增
[中图分类号] R529.3 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2020）17-0128-04
Effectiveness analysis of CSF loop-mediated isothermal amplification and GeneXpert MTB/RIF in the early diagnosis of tuberculous meningitis
FAN Lichao CHEN Yu ZHU Yajuan CAO Hongli
Department of Tuberculosis， the Tenth People's Hospital of Shenyang（Shenyang Chest Hospital）， Shenyang 110044， China
[Abstract] Objective To analyze and compare the efficacy of cerebrospinal fluid loop-mediated isothermal amplification（LAMP） and GeneXpert MTB/RIF（GeneXpert） in the early diagnosis of tuberculous meningitis. Methods A total of 189 patients with suspected tuberculous meningitis from Shenyang Chest Hospital from June 2018 to June 2019 were selected. Cerebrospinal fluid samples from patients before antituberculosis treatment were collected for mycobacterium growth indicator tube（MGIT）， LAMP， and GeneXpert tests. Using the mycobacterium growth indicator tube（MGIT） as the standard， the sensitivity， specificity， positive predictive value， negative predictive value， agreement rate， and Kappa value of the two detection techniques in the diagnosis of tuberculous meningitis were calculated. Results The sensitivity of LAMP was 79.6%， the specificity was 94.3%， the positive predictive value was 83.0%， the negative predictive value was 93.0%， the agreement rate was 90.5%， and the Kappa value was 0.749. The sensitivity of GeneXpert was 98.0%， the specificity was 88.6%， the positive predictive value was 75.0%， the negative predictive value was 99.2%， the agreement rate was 91.0%， and the Kappa value of 0.787. Conclusion The LAMP and GeneXpert in the detection of tuberculous meningitis have significantly higher sensitivity than that of mycobacterium growth indicator tube（MGIT）， which can improve the diagnosis and treatment ability of clinicians to patients with suspected tuberculous meningitis. It is worthy of widespread promotion in the laboratory of primary tuberculosis hospital.
[Key words] Tuberculous meningitis; Cerebrospinal fluid; Loop-mediated isothermal amplification
结核性脑膜炎（tuberculous meningitis，TBM）是脑膜非化脓性炎症，多数由结核分枝杆菌经血液循环或直接途径侵入蛛网膜下间隙而引起，是结核病中最严重的类型之一，该病发病急缓不定，但病程都较长，致残率和死亡率高，故早期诊断和尽早合理规范的治疗，对改善患者的预后，降低后遗症的发病率至关重要[1]。
传统的TBM诊断金标准为脑脊液抗酸染色阳性或脑脊液结核菌培养阳性，但抗酸染色阳性率极低，结核菌培养耗时长，对TBM的早期诊断价值有限。环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术是可以检测结核分枝杆菌的一种新型的恒温核酸扩增技术，该方法操作简单，报告快速，不需要昂贵的仪器设备，比较适合在基层实验室推广应用[2]。而GeneXpert MTB/RIF（简称GeneXpert）是一种新的利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术，目前在肺结核的检测中敏感度和特异度较高，并且可用于脑脊液的检测[3]，本文对沈阳市胸科医院收治的189例疑诊TBM的患者进行了脑脊液LAMP和脑脊液GeneXpert检测，以脑脊液液体培养（MGIT）为金标准，评价两种检测手段检测结核分枝杆菌的敏感度和特异度，探讨其对结核性脑膜炎的诊断价值。
1 对象与方法
1.1 研究对象
选取2018年6月～2019年6月沈阳市胸科医院结核七病区疑诊TBM的患者189例，采集患者抗结核治疗前的脑脊液标本分别进行液体培养（MGIT）、LAMP和GeneXpert检测。
1.2 研究方法
1.2.1 脑脊液的采集和检测 所有患者均取入院后第一次腰穿脑脊液3 mL，标本采集前患者或家属均签署用于本次临床试验采取标本的知情同意书。所有实验部分均由沈陽市胸科医院结核病实验室完成。
1.2.2 MGIT液体培养 收集患者抗结核治疗前的脑脊液，经4%NaOH溶液处理，取0.1 mL接种于酸性罗氏培养基，置于37℃恒温培养箱培养，MGIT960液体培养系统由美国BD公司生产，将脑脊液标本按照BACTECTM MGIT生产规范（MGITTM Procedure Manual）要求进行培养[4]。
1.2.3 LAMP法 收集患者抗结核治疗前的脑脊液，采用荧光目测试剂盒[荣研生物科技（中国）有限公司]，脑脊液吸入吸附剂试管中混匀裂解（90℃，5 min）。将吸附管装到样本处理管上，摇晃5～10次后提取核酸，加上滴注盖，轻压样本处理管将样本滴入反应管中。充分混合后进行LAMP反应，于67℃反应40 min，然后放入恒温荧光核酸扩增LF-160的荧光目视检测单元，通过紫外线激发荧光观察反应结果[5]。
1.2.4 GeneXpert GeneXpert检测仪及试剂盒由美国Cepheid公司生产，具体操作按照说明书进行。收集患者抗结核治疗前的脑脊液，向1 mL脑脊液中加入1 mL样本处理充分混匀，放置15 min并间断摇晃，然后用无菌吸管将2 mL液体移入塑料试剂盒中，后者插入GeneXpert检测平台中，输入样品相关信息后运行仪器会自动进行样品的过滤和洗涤，超声溶菌释放出DNA后与PCR反应试剂混合，半巢式实时扩增并检测荧光信号，根据循环阈值的高（CT<16）、中（16
1.3 统计学分析
用SPSS20.0软件进行统计分析，计算LAMP和GeneXpert的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、一致率和Kappa值。
2 结果
2.1 脑脊液LAMP检测结果及脑脊液GeneXpert检测结果
将189例患者的脑脊液标本进行液体培养（MGIT）、LAMP和GeneXpert检测，液体培养阳性49例（25.93%），LAMP阳性47例（24.87%），GeneXpert阳性64例（33.86%）（表1、2）。
2.2 以液体培养检测结果为标准判断LAMP和GeneXpert检测技术的诊断效能
以液体培养结果为标准，LAMP的敏感度为79.6%，特异度为94.3%，阳性预测值为83.0%，阴性预测值93.0%，一致率90.5%，Kappa值=0.749，说明两者一致性较好。以液体培养结果为标准，GeneXpert的敏感度为98.0%，特异度为88.6%，阳性预测值为75.0%，阴性预测值为99.2%，一致率为91.0%，Kappa值=0.787，说明两者一致性较好（表3）。
3讨论
TBM是结核病最严重的类型之一，据统计，2017年全世界有1000万人罹患结核，其中每年估计有10多万例TBM新病例。面对如此严峻的疫情，TBM的诊断和治疗情况却不是很乐观，因为TBM的临床症状不典型，脑脊液载菌量低，导致病原学诊断率很低[7]。有文献报道，早期确诊的结核性脑膜炎病死率低于10%，而晚期确诊的结核性脑膜炎病死率高达60%以上[8]。因此早期诊断对TBM患者至关重要，LAMP和GeneXpert等新的诊断技术的出现，有望提高结核性脑膜炎的早期诊断效率，以改善TBM患者的预后，提高治愈率，降低致残率和死亡率。
本研究中脑脊液LAMP法检测的敏感度为79.6%，特异度为94.3%，阳性预测值为83.0%，阴性预测值93.0%，一致率90.5%，Kappa值=0.749，说明两者一致性较好。因此可认为LAMP的检测结果接近液体培养（MGIT）结果，且比液体培养（MGIT）可检测出更多的病原学阳性患者。刘洋等[9]采用LAMP检测结核性胸膜炎患者的胸腔积液标本，灵敏度高达75.8%，显著高于涂片法的39.6%，证明LAMP检测可广泛应用于肺外结核标本的检测，且阳性率更高。
孙雯雯等[10]报道，在环介导等温扩增技术早期诊断结核性脑膜炎的研究中，在LAMP法检测阳性的病例中，有2例最后排除结核性脑膜炎诊断，提示本研究存在一定的假阳性率，主要原因可能是LAMP技术的高敏感性使样品与反应体系污染，因此为了避免假阳性的出现，在操作工程中需实行分区操作，注意防止样品间的交叉污染，严格控制可能导致污染的机会，避免假阳性的出现。
另外，本实验也分析了LAMP检测与液体培养不一致的18例结果，其中LAMP检测阳性而液体培养检测阴性为8例，LAMP检测阴性同时液体培养阳性者10例。分析原因可能为：①液体培养阳性而LAMP阴性：标本性状的影响，操作者采样位置的影响，因LAMP只需要60 μL的标本，采样时有可能会错过阳性部位。②液体培养阴性而LAMP阳性：液体培养法检出为活菌，而LAMP检测的对象为结核分枝杆菌DNA，无论细菌是否存活皆能检出[11]。
目前GeneXpert检测痰标本用于肺结核的诊断已得到国际上的认可，文献报道GeneXpert的灵敏度和特异度均很高，肺结核诊断总特异性为98.4%，总灵敏度为90.4%。但其对脑脊液、胸腹腔积液、关节液和心包积液等不同标本的敏感度有较高的异质性，需要更深的更大样本量的研究[12]。在本研究中GeneXpert的敏感度为98.0%，特异度为88.6%，阳性预测值为75.0%，阴性预测值为99.2%，一致率为91.0%，Kappa值=0.787，说明两者一致性较好。GeneXpert能够快速检测脑脊液中的结核分枝杆菌以及利福平耐药，灵敏度较高，但阴性结果无法排除TBM的诊断[13]。目前国内外已经有多个研究，对超过1000份脑脊液进行GeneXpert检测，评价GeneXpert诊断TBM的灵敏度约为80%，但是这些研究的脑脊液标本量较少，2009年英国感染学会《中枢神经系统结核病诊断和治疗指南》建议，对于TBM患者，应该在抗结核药物治疗前留取不少于6 mL脑脊液进行病原学检查，因此如果可能希望能够每例获得6 mL脑脊液通过离心富集结核菌进一步评价GeneXpert的检测价值。
在本研究中，采用LAMP和GeneXpert检测脑脊液敏感度和特异度较高，甚至高于国外的一些研究，考虑与纳入的研究样本有关，我科室收治的患者为辽宁省内疑难重症病例，多为晚期TBM，患者病情重，脑脊液载菌量高有关，所以LAMP和GeneXpert检测的阳性率较高。
综上所述，LAMP作为一种新型的核酸扩增技术，所需的仪器设备简单，价格低廉。可以针对靶基因设计引物，有较高特异性，且整个扩增过程较快，约60 min即可完成，操作步骤簡单，肉眼即可判断结果，对检验人员要求较低[14]。与传统的细菌学检测手段相比，其操作更加容易、便捷、生物安全性更好。GeneXpert可检测结核分枝杆菌感染和RIF耐药基因，扩增的靶基因为利福平耐药基因相关基因的81个碱基对的高突变热点区域，整个过程用时短，约2 h可完成，操作简单，几乎为全自动化检测，全天可完成超过1000个样本[15]。且GeneXpert阳性率明显高于液体培养，在有条件的医疗机构，有较广泛的应用前景。LAMP和GeneXpert对TBM检测的灵敏度较液体培养（MGIT）明显提高，并且与液体培养结果一致性较好，GeneXpert同时可提供利福平耐药情况，LAMP操作简单、价格低廉，可以在一定程度上提高临床医生对疑似TBM患者的诊治能力，值得在基层结核病院实验室广泛推广。
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（收稿日期：2020-02-05）
