固相净化-涡旋辅助-温控相变-离子液体液液微萃取高效液相色谱法同时测定大豆蛋白饮品中三嗪和苯脲类除草剂

徐尉力　李吉龙　马铭扬　王林　陈姝蓉　王志兵　张寒琦

摘 要 建立了一种快速、高效、绿色的固相净化-涡旋辅助-温控相变-离子液体液液微萃取技术，结合高效液相色谱，同时测定大豆蛋白饮品中6种三嗪和苯脲类除草剂，包括灭草隆、绿麦隆、阿特拉津、绿谷隆、扑灭津和扑草净。本研究采用疏水性低密度固态季膦盐离子液体（[P4 4 4 12]BF4）作为萃取剂，通过固相净化除去样品中的蛋白质和脂肪等杂质，经水浴和涡旋促进离子液体在样液中的分散，并通过控制温度，使离子液体由液态转变为固态，从而实现离子液体与样液的分离，达到萃取分析物的目的。优化了离子液体种类及用量、净化剂种类及用量、盐的用量、涡旋时间以及pH值等实验条件。6种目标物在各自的线性范围内具有良好的线性关系（R≥0.9994），检出限和定量限分别为0.52～2.59 μg/L和1.72～8.63 μg/L，加标回收率为82.6%～118.2%。本方法简单高效、绿色环保、试剂用量少，适用于大豆蛋白饮品中三嗪和苯脲类农药残留的提取与测定。

关键词 固态离子液体; 液液微萃取; 固相净化; 三嗪和苯脲类除草剂; 大豆蛋白饮品; 高效液相色谱

1 引 言

大豆的加工和食用历史已有数千年之久[1]，大豆蛋白饮品作为大豆深加工产品之一，具有重要的食用价值[2，3]。三嗪类和苯脲类除草剂常被用于豆科作物田间杂草的防治[4]，两者均是通过抑制植物的光合作用而控制杂草[5，6]。目前，欧盟规定植物源性食物中三嗪和苯脲类除草剂的限量标准（Maximum residue limits， MRLs）为0.01 mg/kg[7]，而我国国家标准GB/T 5009.133-2003[8]规定大豆中绿麦隆的MRLs为0.01 mg/kg，GB 2763-2019[9]规定大豆中扑草净的MRLs为0.05 mg/kg。由于这两类除草剂的使用范围广、用量大[10]、降解周期长[11]、水溶性好[12]，因而易残存于环境水和土壤中[13]，通过植物的富集作用残留于大豆中。此外，近年来，农药制假售假、超标使用等现象屡有发生，对大豆深加工产品的安全性产生一定影响[14]。因此，建立简单、高效和绿色的方法用于大豆蛋白饮品中三嗪类和苯脲类除草劑的分离与检测尤为重要。

由于苯脲类除草剂具有较高的热稳定性，难以用气相色谱检测[15]，而毛细管电泳法检测器单一，适用性不强[10]。因此，常用于检测大豆产品中三嗪和苯脲类除草剂的方法主要有高效液相色谱法[15]、高效液相色谱-质谱联用法[16]和超快速液相色谱法[17]等，其中，高效液相色谱法具有适用范围广、操作性强[7]、性价比高[18]等优点。

在色谱分析之前，需对样品进行有效的前处理。针对大豆产品中农药残留，常用的萃取方法有QuEChERS法[14]、固相萃取法[19]和液液微萃取法[20]等，其中，液液微萃取法常被用于液体样品中目标物的提取与富集。但大多数液液微萃取法使用乙腈、丙酮或正己烷等有机溶剂作为萃取剂，且操作步骤复杂，萃取时间长。而离子液体是一种“绿色”的熔融盐，具有适宜的极性。 朴惠兰等[21]采用500 mg [C4MIM][HSO4]作为萃取溶剂，以分散液液微萃取法进行样品前处理，对果汁饮品中的三嗪类除草剂进行了分析检测，检出限达到0.06～0.18 ng/mL。但在萃取过程中，目标物的富集过程多采用氮吹、旋蒸或离心等操作[18]，且液液相分离后，离子液体部分很难完全取出，从而造成目标物在转移过程中的损失。相对于室温液态水溶性离子液体而言，新型固态离子液体的熔点较低，可以通过控制温度实现相转化[22]，有利于提高目标物的富集和浓缩的效率。常用于萃取分离的固态离子液体有季膦盐、季铵盐离子液体等，其熔点普遍较低，在室温下通常呈固态，由于其具有一定碳数的烷基链、苯环和羟基等活性基团，这些固态离子液体对大多数有机化合物具有良好的溶解性，常用于农药残留的萃取分析。

由于大豆产品属于高蛋白食物，其中含有大量蛋白质、脂肪和活性物质，基质效应明显[14]，提取和检测过程易受到干扰。固相净化作为一种有效的净化方法，常用于去除大豆蛋白饮品中的干扰物质[15，20]，但大多依托重力条件进行净化[16，19]，净化速度慢，程度不均一，并且易堵塞。基于此，本研究将蠕动泵与固相净化柱相接，以恒定流速实现样液的可持续净化，以疏水性低密度固态季膦盐离子液体为萃取剂，通过涡旋辅助促进离子液体在样液中的分散，通过水浴-冰浴温度变化控制离子液体在样液中的液化与凝固，建立了固相净化-涡旋辅助-温控相变-离子液体液液微萃取豆制品中三嗪类和苯脲类农药残留的方法。结合高效液相色谱，建立了同时测定大豆蛋白饮品中6种三嗪和苯脲类除草剂的方法。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

1100型高效液相色谱仪（美国Agilent公司），配有自动进样器、四元泵、柱温箱、脱气机和二极管阵列检测器; AcclaimTM120-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm，美国Thermo Fisher Scientific公司）; BT100S型蠕动泵（上海笃特科仪器有限公司）; XW-80A漩涡混合器（上海米青科实业有限公司）; HH-1型恒温水浴锅（嘉兴俊思电子有限公司）; IMS-20型全自动雪花制冰机（常熟市雪科电器有限公司）; KQ-100DE超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司）。

扑灭津（Propazine）、阿特拉津（Atrazing）、扑草净（Prometryn）、灭草隆（Monuron）、绿麦隆（Chlortoluron）和绿谷隆（Monolinuron）（纯度>99%，阿拉丁试剂公司），结构如图1所示。三丁基辛基膦四氟硼酸盐（[P4 4 4 8]BF4）、三丁基十二烷基膦四氟硼酸盐（[P4 4 4 12]BF4）、三丁基十六烷基膦四氟硼酸盐（[P4 4 4 16]BF4）和三丁基十二烷基铵四氟硼酸盐（[N4 4 4 12]BF4）（上海成捷化学有限公司）; PSA、硅胶、硅藻土、弗罗里硅土、酸性氧化铝、中性氧化铝和碱性氧化铝（阿拉丁试剂公司）; 乙腈、甲醇（色谱级，科隆化学品有限公司）; 其它试剂均为国产分析纯。

2.2 标准溶液的配制

准确称取6种除草剂标准品各5.00 mg，用乙腈溶解并定容至10 mL，配制成500.00 μg/mL的标准储备液，于4℃避光保存，备用。后续实验所用工作溶液均由各标准储备液经乙腈稀释得到。

2.3 样品制备

2.3.1 样品制备 6种不同品牌的市售包装豆奶样品（分别命名为样品1～6）和3种不同品牌的豆浆粉样品（分别命名为样品7～9），均购于当地超市。其中，市售包装豆奶开袋后直接用于加标样品制备和后续样品处理; 对于豆浆粉（样品7～9），先分别取30.0 g样品粉末于250 mL烧杯中，加入180.0 mL 80℃超纯水，均匀搅拌2 min，制成豆浆样液后，用于加标样品制备和后续样品前处理。除3.3.4节中实际样品分析外，其余所有实验结果均以样品1（即某品牌的市售包装豆奶）为分析样本而获得。

2.3.2 加标样品制备 用乙腈稀释标准储备液，配制浓度为2.50、5.00、10.0、25.0、50.0和100.0 μg/mL含有6种目标物的混合标准溶液，分别吸取0.40 mL加入到40.0 mL上述原始豆奶样品和制备的豆浆样液中，搅拌10 min至混合均匀，制成加标浓度分别为25.0、50.0、100.0、250.0、500.0和1000 μg/L的加标样品。

2.4 实验方法

2.4.1 三氯乙酸除蛋白 取上述40.00 mL原始样品或加标样品于50 mL离心管中，加入2.0 mL 10%（m/V）三氯乙酸，大力振摇1 min后，以7000 r/min离心5 min，取25.0 mL上清液（全部上清液）于100 mL烧杯中。向离心管中加入适量超纯水，混匀后重复上述离心操作，将两次离心后获得的上清液合并，总体积为40.0 mL，即为除蛋白后的样液。

2.4.2 固相净化

在蠕动泵的辅助下，上述除蛋白后的样液以10 mL/min通过自制的中性氧化铝固相萃取小柱，进行净化，流出液用底部塞有柱头塞的5 mL注射器收集，得到固相净化后的样液。

2.4.3 涡旋辅助-温控相变-离子液体液液微萃取 萃取流程如图2所示。首先，向收集了4.0 mL净化后样液的注射器管内准确加入0.3 g NaCl和0.03 g [P4 4 4 12]BF4，混合后，于40℃水浴保持5 min，以促进固态离子液体溶化与分散。将注射器管塞上柱塞，涡旋3 min，萃取結束后再冰浴10 min，待离子液体重新固化后，拔下柱头塞，排出下层液体，目标物则富集于离子液体中，与样品溶液分离。将所获得的离子液体用300 μL乙腈回溶，过0.22 μm滤膜后，进行HPLC分析。

2.5 色谱分析

流动相A为水， B为乙腈， 洗脱梯度：0 min， 50% B; 0～18 min， 50%～55% B; 18～25 min， 55%～80% B; 25～30 min， 80%～50% B; 30～40 min， 50% B。流速0.5 mL/min， 进样体积20 μL， 柱温30℃; 三嗪类（扑灭津、阿特拉津和扑草净）和苯脲类（灭草隆、绿麦隆和绿谷隆）除草剂的最佳检测波长分别为222和245 nm。

3 结果与讨论3.1 样品前处理

大豆蛋白饮品中含有大量的植物蛋白，通常用强酸去除蛋白质[7]。本研究通过加入三氯乙酸使蛋白质变性沉淀，在最优实验条件下，9种样品中蛋白质的去除率>80%。

对于富含大豆蛋白的饮品，多采用固相净化法对其进行净化处理[15，17]，即通过固相吸附剂除去样品基质中存在的蛋白质、异黄酮、酚类物质和脂肪等杂质，以避免对色谱系统的污染。经过固相净化处理后，9种样液清澈透明，乙腈回溶后无杂质沉淀析出，色谱系统压力稳定。

由于本研究所用的离子液体是低密度疏水性固态离子液体（[P4 4 4 12]BF4），通过温度控制可以实现离子液体固液转化，有利于其在样液中分散。适当的涡旋会加速离子液体的分散速度和程度，增大与目标分析物的接触面积和几率。冰浴能在短时间内使其重新凝固在萃取管的管壁上，实现离子液体相和水相的快速分离。

3.2 萃取条件优化

3.2.1 固相净化剂种类及用量 固相净化是豆制品中除草剂检测常用的除杂方法。本研究对PSA、弗罗里硅土、硅胶、硅藻土、氧化铝等常见的净化剂[23，24]进行比较发现，采用PSA作为净化剂时，样液清澈，净化效果最好，但因其具有较强的极性，对目标物有吸附作用; 弗罗里硅土、硅胶和硅藻土均属于多孔结构的硅酸盐，表面具有较多的羟基，可与目标物产生较强的氢键相互作用，但对溶液中的酸性蛋白质的吸附性能较弱，各目标物回收率低至20%～60%，且乙腈回溶后的样液中易出现少量蛋白质析出，影响液相系统稳定性和灵敏度; 氧化铝类吸附剂主要是通过离子交换作用对化合物产生吸附作用，尤其是中性氧化铝对偏中性环境（pH=6～8）中的酮、醛、配糖物和水溶性游离小分子蛋白质易产生吸附作用[24]。由图3A可见，中性氧化铝作净化剂时对目标分析物的干扰较小，回收率为91.9%～101.7%， 且净化后的样液较清澈，乙腈回溶后无杂质沉淀析出，这也与国标GB/T 23816-2009[25]中的净化方法类似。

3.2.2 固相净化剂用量对回收率的影响 由图3B可见，净化剂用量从0逐渐增加至2.0 g时，目标物的回收率略有降低，但仍接近100%; 但当净化剂用量从2.0 g增加至6.0 g时，回收率迅速下降到50%左右。综合考虑净化剂的除杂效果和对目标物的吸附作用，选择2.0 g中性氧化铝作为净化剂进行后续实验。

3.2.3 离子液体种类和用量对回收率的影响 相对于咪唑基离子液体，季膦盐和季铵盐离子液体属于疏水性离子液体，与水不相混溶，可实现萃取后的快速聚集[26]; 其中，低密度固态离子液体与水相的界面分层明显，分离过程更加快速、彻底[27]。因此，本研究选用疏水性低密度固态季膦盐离子液体作为萃取剂，考察了不同中心阳离子和不同烷基链长度对萃取过程和效果的影响。由图3C可见，中心阳离子为P+的离子液体对各目标物的萃取效果强于中心阳离子为N+的离子液体，且对于季膦盐离子液体，[P4 4 4 12]BF4对各目标物的萃取效果优于[P4 4 4 8]BF4和[P4 4 4 16]BF4。这是由于季铵盐中的N+化合物比季膦盐中的P+化合物具有更小的离子半径，因而更易形成较强的离子键，会对样液中的强极性化合物产生较强的吸附作用，而对弱极性目标分析物的萃取性能相对较差，这与文献[28，29]报道的结果一致。当季膦盐离子液体作为萃取剂时，对各目标物的萃取效果均较好，但随着烷基链的增加，季膦盐离子液体的疏水性和熔点逐渐增加[17，28]，使得[P4 4 4 8]BF4在冰浴条件下固化不完全，而[P4 4 4 16]BF4在水浴中难以融化，影响实验操作。因此，本研究选用[P4 4 4 12]BF4作萃取剂。

离子液体用量的影响如图3D所示，随着离子液体用量增加，各目标物的回收率先增加后减少，当离子液体用量为0.03 g时，回收率达到最大值。本研究选用0.03 g [P4 4 4 12]BF4作为萃取剂。

3.2.4 NaCl用量对回收率的影响 NaCl的加入会改变样液的离子浓度，降低目标物在水溶液中的溶解度，进而增加目标物在离子液体中的分配。据文献报道，采用离子液体液液微萃取法萃取大豆中的三嗪类除草剂时，适量加入NaCl可增加目标物在离子液体中的溶解度，有利于目标物的萃取[21，30，31]。如图3E所示，随着NaCl用量增加，各目标物的回收率逐渐上升，当NaCl用量为0.3 g时，各目标物的回收率达到最大值。本研究选择NaCl的用量为0.3 g。

3.2.5 涡旋时间对回收率的影响 如图3F所示，随着涡旋时间延长，目标物的回收率显著增加，当涡旋时间达到3 min时，各目标物回收率达到最大值，继续延长涡旋时间，目标物回收率略微下降，并趋于稳定。因此，为了节约时间和提高富集效果，本研究选择涡旋时间为3 min。

3.2.6 pH值对回收率的影响 pH值影响目标物解离状态。当pH=6～7时，各目标物的回收率达到最大值，而样品pH≈6。因此，本研究不调节样液的pH值。

3.3 方法学评价

3.3.1 方法分析性能 使用各目标物的标准储备液配制浓度为100.0、 50.0、 25.0、 12.50、 6.25、 3.13、 1.56、 0.78、 0.39、 0.20和0.10 μg/mL的系列混合标准溶液，分别吸取0.40 mL加入到40.00 mL 12组空白样品（样品1）中，搅拌10 min使混合均匀，得到含有6种目标物的系列浓度（1000、 500、 250、 125、 62.5、 31.3、 15.6、 7.8、 3.9、 2.00和1.00 μg/L）的加标样品，在最佳实验条件下，按照2.4节和2.5节所述方法对目标物进行提取和分析，以目标物浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制工作曲线。各目标物在各自线性范围内表现出良好的线性关系（R≥0.9994），通过测定11组低浓度空白加标样品（样品1），计算得到本法的检出限（S/N=3）和定量限（S/N=10）分别为0.52～2.59 μg/L和1.72～8.63 μg/L。各分析物的线性方程、检出限和定量限如表1所示。

3.3.2 日内和日间精密度 样品1按照2.3.2节所述方法进行加标，得到3组不同浓度（25.0、 50.0和100.0 μg/L）的加标样品，将制备好的加标样品于4℃避光保存，在最优萃取条件和色谱条件下，每隔1周对加标样品分析3次，连续分析5周，测得6种目标物的日内和日间精密度（RSD）分别为0.06%～4.1%和0.03%～6.5%，说明本方法具有较好的精密度和重现性。

3.4 实际样品分析

采用本方法对9种不同品牌的豆奶和豆浆粉（样品1～9）进行分析。实验结果如表2所示，所有样品中均未检出三嗪和苯脲类除草剂，各目标物在不同加标浓度（25.0和100.0 μg/L）下的回收率在82.6%～118.2%之间，相对标准偏差为0.1%～28.2%。样品1的色谱图如图4所示，由于三嗪和苯脲类化合物的最佳检测波长分别为222和245 nm，本研究采用双波长检测法对目标物进行定性和定量分析，由图4可见，各目标物保留时间内色谱图干净、无杂峰，且空白样品中无三嗪和苯脲类除草剂残留。

3.5 方法的比较

与参考文献中的方法相比，本方法使用离子液体代替传统有溶剂作为萃取剂，既减少了萃取溶剂的用量，也减轻了对实验人员身体的危害。将离子液体液液微萃取与高效液相色谱相结合，通过控制温度实现萃取溶剂和样品溶液的快速分离，使提取、富集过程变得简单、高效，同时使目标化合物的检出限更低，回收率更合理，方法具有更高的灵敏度（表3）。因此，相对于其它方法，本方法在萃取溶剂的安全性、操作的简便性以及高效性方面具有一定的优势。

4 结 论

选用市售大豆蛋白饮品作为分析样品，通过固相净化-涡旋辅助-温控相变-离子液体液液微萃取法对大豆蛋白饮品中的6种三嗪和苯脲类除草剂残留进行提取与富集，并通过高效液相色谱法进行检测和分析。研究结果表明，固相凈化可显著减少乙腈回溶后样液中蛋白质沉积现象，以离子液体代替传统有机溶剂作为萃取剂，不仅绿色环保，而且使溶剂用量大大减少， 同时集提取、富集和分离于一体，操作简单、易分相，可用于大豆蛋白饮品中三嗪和苯脲类除草剂的分析与检测。

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1（College of Chemistry and Life Science， Changchun University of Technology， Changchun 130012， China）

2（College of Chemistry， Jilin University， Changchun 130012， China）

Abstract An efficient， fast and green ionic liquid-liquid liquid microextraction on the basis of solid phase clean-up combined with temperature controlled method was established for the extraction of six triazine and phenylurea herbicides （monuron， chlorotoluron， atrazine， monolinuron， propazine and prometryn） from soy product samples. The impurities such as protein and fat in the samples were removed by solid phase clean-up. Hydrophobic low-density solidified ionic liquid （[P4 4 4 12]BF4） was used as extraction solvent， which was dispersed into the samples solution and formed fine droplets with the help of water-bath and vortex method. Finally， to achieve the purpose of extracting the analytes， the solidified ionic liquid enriched with the target was separated from the sample solution by changing temperature. Some extraction conditions， such as type and amount of ionic liquid， type and amount of absorbent， ionic strength of sample solution， vortex time and pH value were investigated. The experimental results showed that the target analytes exhibited good correlation coefficients （R2≥0.9994） in the linear range. The limits of detection （LODs） and quantification （LOQs） were in the range of 0.52-2.59 μg/L and 1.72-8.63 μg/L， respectively. The spiked recoveries were in the range of 82.6%-118.2%. The proposed method showed many advantages such as simplicity， high efficiency， green and low reagent consumption， and could be successfully applied to the extraction of triazine and phenylurea herbicide residues form soy product samples.

Keywords Ionic liquid; Liquid-liquid microextraction; Solid phase extraction; Triazine and phenylurea herbicides; Soy milk; High performance liquid chromatography

（Received 4 November 2019; accepted 6 June 2020）

2019-11-04收稿; 2020-06-06接受

本文系吉林省教育廳“十三五”科学技术项目（No. JJKH20181014K）资助

* E-mail：wangzhibing@ccut.edu.cn