螭霖鱼肠道微生物多样性分析

李慧，李宇飞，孟子育，郁家宝，赵永正，夏倩倩，孟超，田园

（山东第一医科大学（山东省医学科学院）生命科学学院，山东 泰安 271016）

螭霖鱼（Varicorhinus macrolepis），属鲤科，国家二级保护动物，野生群体仅分布在泰山部分溪流中。其富含丰富的矿物质、微量元素，具有较高的营养和经济价值。近年来，由于水质变化及化学药物使用等因素，养殖螭霖鱼种群中出现抗病力下降、病死率增加现象。如何提高鱼群的生态健康发展，是目前要面对的主要问题。

鱼类肠道是鱼体内接于食道（无胃鱼）或胃（有胃鱼）后，止于肛门的一种管状消化器官[1]，主要负责消化和吸收，也参与体内的免疫反应、新陈代谢和多种应激反应[2]。那些与鱼类存在共生关系或协同进化关系的鱼类肠道微生物生态系统庞大而复杂，包含许多不同种类的细菌，多由好氧菌、兼性厌氧菌和专性厌氧菌组成，是一个大型动态菌群。对于大多数鱼类来说，稳定的肠道微生物区系对多种宿主功能都有影响[3]。肠道菌群的生态稳定，对辅助机体进行消化吸收、帮助机体抵御外界病毒害、调节宿主的免疫机能等有重要作用[4-5]。在漫长的进化过程中，机体与菌群联系外界环境，形成了一个稳定的整体，共同进化，互利互惠，使肠道菌群也成为了鱼类健康生长繁殖的中的保障因素，如果菌群失衡，将有可能导致各类疾病的产生，最终影响机体健康。

Han[6]和王纯[7]曾分别采用过克隆文库的方法和DGGE技术对草鱼的肠道微生物进行过探索。DGGE和基因克隆技术简单高效，但检测限低，具有较大局限性，更适合反映细菌群落的优势种群，尚不能全面系统地揭示细菌群落结构和多样性[8]。近年来，高通量测序技术因其特异性高、准确率高和测序数据量大的特点在鱼类肠道微生物群落研究中得到广泛应用[9-12]。目前关于螭霖鱼肠道菌群的研究鲜见报道。

该研究采用16 S扩增子测序平台NovaSeq PE250对螭霖鱼肠道微生物DNA进行测序，有利于低丰富群落物种的鉴定，从而提高螭霖鱼肠道微生物群落研究的精准性。这将为螭霖鱼肠道菌群的多样性及协同进化关系研究提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 供试鱼

试验采用的螭霖鱼来自山东省泰安市彩石溪养殖场。水体温度控制在18~22℃。螭霖鱼每天喂食两次。螭霖鱼的喂食以活鱼虫（含枝角类、挠足类和摇蚊幼虫等）为主，辅以人工配合饲料。人工配合饲料配方为：进口鱼粉44.7%，优质豆粉22.9%，玉米粉29.4%，氨基酸强化营养素3%，维生素添加剂0.03%，微量元素添加剂0.05%。

1.2 主要试剂及仪器

无水乙醇，Goldview，蛋白酶K，去离子水，RNase，琼脂糖，粪便基因组DNA提取试剂盒（Solarbio），PCR Buffer10组，MgCl22.5mM，dNTP mixture 2.5mM，TaqE 2.5 U/μL 和 5.0 U/μL（宝生物工程有限公司），灭菌无离子水，引物（5 pm/μL）。

1.3 样品采集

随机挑取3条健康无损的螭霖鱼（鱼龄1年），体长8~12 cm，饥饿处理24 h。置于超净工作台中，使用75%酒精擦拭白甲鱼体表后用蒸馏水漂洗；解剖鱼体，将其肠道分离并置于高压灭菌后的培养皿中；将小肠纵向剪开，用灭菌手术刀片将小肠内壁粘膜缓慢刮下来，置于1.5 mL离心管中，即为小肠肠道内容物样品，最后放于-80℃保存备用。

1.4 基因组DNA提取和PCR扩增

采用CTAB或SDS方法对样本的基因组DNA进行提取，并利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度。采用引物515F（5′-GTGCCAGCMG CCGCGGTAA-3′）和 806R（5′-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3′）扩增细菌16S rRNA基因V4区。PCR反应体系（20 μL）：5×Phusion○RHigh-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer 4 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，TransStart○RFastPfu DNA Polymerase（2.5 U/μL）0.5 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各 0.5 μL，样品 DNA 2 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR 反应条件：98 ℃ 1 min；98 ℃10s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30s，30 个循环；72 °C 5min。测序由北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.5 生物信息学的分析

用 Qiime软件（Version 1.9.1）[13]计算相关指数，使用R软件（Version 2.15.3）绘制物种多样性曲线。利用UPARSH软件对样本的全部有效数据进行聚类，默认97%的一致性将序列聚类为OUTs（Operational Taxonomic Units）；利用Mothur方法和SILVA132的SSUrRNA数据库对OUTs代表序列进行物种注释；利用MUSCLE软件进行快速多序列比对以获得所有OTUs代表序列的系统发生关系。

2 结果

2.1 测序概述

该次数据结果如表1所示，过滤嵌合体后，最终用于后续分析的Tags序列平均长度为253 bp。3个样本共得到250 958条序列，单个样本序列范围为80 895~86 112条，其中质控后可用于后续分析的有效序列共192 784条，单个样本序列范围为62 117~68 449条。

表1 样品QC之后序列统计总表

2.2 物种多样性曲线

对所得有效数据构建稀释曲线（图1A）和等级聚类曲线（图1B）。从图1A中可以看出，稀释曲线逐渐趋于平稳，说明测序数据量渐进合理，加大数据量，基本上不会再产生较多的新物种数（OTUs）。由图1B可以看出，曲线在水平方向的横轴上跨度较大，说明物种丰富度高；在垂直方向上曲线坡度较大，说明物种分布不均匀。

2.3 Alpha Diversity指数分析

由Alpha多样性分析可知，3个重复样本的物种丰富度和均匀度上存在较小的差异，3个样品OTU的覆盖率分别为99.8%，99.9%和99.9%（表2所示），说明样品中有未被测出的序列的概率较低，测序数量已饱和，能够真正反应赤鳞鱼肠道微生物菌群结构及组成多样性。对比3个3个样品，R.S.1的chao1指数最高为740.615，表明R.S.1的物种丰富度最大。同时发现R.S.2的Shannon指数最高，R.S.3最低，由此可见R.S.2和R.S.3群落物种多样性存在差异。

2.4 螭霖鱼肠道中在主要细菌群落分布

根据物种注释结果，选取每个样本或分组在各分类水平上最大丰度排名前10的物种，生成物种相对丰度柱形累加图（图2）。如图2A所示，在门水平上，拟杆菌门（Bacteroidetes）（46.96%）、变形菌门（Proteobacteria）（48.70%）占据优势地位，其次为厚壁菌门（Firmicutes）（37.38%），其他细菌门类占比较少。在科水平上，如图2B所示，黄杆菌科（Flavobacteriaceae）占优势地位，伯克氏菌科（Burkholderiaceae）和气单胞菌科（Aeromonadaceae）丰度较高，假单胞菌科（Pseudomonadaceae）等其他类别的相对丰度不足1%。在属水平上，如图2C所示，黄杆菌属（Flavobacterium）（44.72%）、蓝黑紫色杆菌属（Janthinobacterium）（9.39%）和气单胞菌属（Aeromonas）（9.29%）的丰度较高，为优势菌种，尤其是黄杆菌属（Flavobacterium）在属水平上占据最优势地位。其他所占比例较少。

图1 稀释曲线（A）和等级聚类曲线（B）

表2 赤鳞鱼肠道菌群Alpha多样性统计表

图2 螭霖鱼肠道中细菌在门（A）、科（B）、属（C）水平中的相对丰度柱形图

2.5 特定物种分类树组成分析

对每个样本或每个分组的物种分类结果进行物种分类树[14]统计（图3）。从图3可以看出，螭霖鱼肠道菌群所含细菌种类主要分布在类杆菌门（Bacteroidia）、厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）3个门，其中类杆菌门约占57.44%，占绝对优势；从纲的分类水平来看,以类杆菌纲（Bacteroidia）为主，占57.44%；在目的水平上，以黄杆菌目（Flavobacterium）为优势目，占比57.44%。在属的水平上，以黄杆菌属（Flavobacterium）和蓝黑紫色杆菌属（Janthinobacterium）为优势属，其中黄杆菌属（Flavobacterium）占比55.94%，兼具主要优势。

图3 螭霖鱼特定物种分类树

2.6 系统进化分析

为了进一步研究属水平物种的系统进化关系，通过多序列比对得top100属的代表序列的系统发生关系，结果见图4。由图4可知，类杆菌属（Bacteroidia），变形菌属（Proteobacteria）和黄杆菌属（Flavobacterium）相对丰度较高，且系统进化关系比较接近。其次是梭菌属（Clostridia）和异常球菌-栖热菌属（Deinococcus-Thermus）在系统进化上较为接近。图4中树形表现出多个分支，但最终聚为一支，说明这些物种在进化上基本趋于一致。

图4 属水平物种系统进化关系

3 讨论

本实验采用高通量测序技术的方法，选取了三条螭霖鱼作为样本，提取其肠道内容物的微生物DNA，并进行微生物多样性分析。通过对稀释曲线的测定可知，曲线已达到饱和，说明样品测序量足够且合理，能够反应其肠道微生物多样性及结构组成。

试验结果表明，3个样本共得到250 958条序列。基于97%的样本相似度，样本优化聚类为1200个 out（Operational taxonomical unit），共涉及 13 门24纲42目56科75属。在门水平上，拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）为螭霖鱼肠道的优势菌门，这与文献中记载的其他鲤科生物，如草鱼、鲢鱼、团头鲂、鲤鱼等肠道的优势菌门及含量有略有差异[15]。相关研究表明，厚壁菌门最主要的功能是降解纤维类物质，而拟杆菌门主要降解非纤维物质，厚壁菌门和拟杆菌门在动物肠道的相对比例与宿主的食性和代谢息息相关[16-17]，进而推测肠道菌群对螭霖鱼丰富的营养价值及独特的生存环境有重要影响。在科水平上，黄杆菌科（Flavobacteriaceae）占优势地位，伯克氏菌科（Burkholderiaceae）和气单胞菌科（Aeromonadaceae）丰度较高，其他菌如假单胞菌科（Pseudomonadaceae）等相对丰度不足1%。在属水平上黄杆菌属（Flavobacterium），蓝黑紫色杆菌属（Janthinobacterium）和气单胞菌属（Aeromonas）为主要优势菌种，其次是假单胞菌属（Pseudomonas）,芽孢杆菌属（Bacillus）希瓦氏菌属（Shewanella），伊丽莎白杆菌属（Elizabethkingia），马赛菌属（Massilia）和嗜血杆菌属（Haemophilus）。其中黄杆菌属（Flavobacterium）丰度最高，占绝对优势所占比例为44.72%，该菌为严格好氧菌，培养温度应低于30℃，这说明该菌对螭霖鱼生存水域的温度和溶氧量有严格要求，这可能是其较难养殖的原因之一。此外，黄杆菌属（Flavobacterium）对降解杀虫剂中主要成分甲氰菊酯具有一定的作用，这说明样本所生活的水域系统已遭到一定的破坏。蓝黑紫色杆菌属（Janthinobacterium）会产生化合物——紫色杆菌素，具有抗革兰阳性菌和植物致病菌的作用[18]，由此推测螭霖鱼肠道携带蓝黑紫色杆菌可以使其在污染的水体环境中存活。芽孢杆菌属与螭霖鱼互利共生，螭霖鱼为其提供寄生环境，并提供其正常生命活动所需的营养物质，而芽孢杆菌在肠道中能分泌很多活性很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等，有助于降解植物性饲料中某些复杂的碳水化合物，拮抗肠道内的氧气，以维持其肠道的生态平衡。芽孢杆属因其无毒性，能分泌多种酶类，生命过程能以孢子体形式存在，耐高温等能力强等优点，可对螭霖鱼肠道内该菌属进一步分离研究，将其作为微生态添加剂，这对于螭霖鱼的养殖保护有广阔前景。

根据系统进化树，树形表现出多个分支，但最终聚为一支，推断这些物种在进化上基本趋于一致。结果显示，类杆菌属（Bacteroidia），变形菌属（Proteobacteria）和黄杆菌属（Flavobacterium）相对丰度较高，且系统进化关系比较接近。其次是梭菌属（Clostridia）和异常球菌-栖热菌属（Deinococcus-Thermus）在系统进化上较为接近。这表明，螭霖鱼肠道种微生物群落组成较为相似，无显著差异。综上，该菌群所含种类丰富，群落结构遗传进化较为稳定。可能是由于泰山地区位于多河交汇处，自然条件适合螭霖鱼的生存，经长期演变，形成独特的珍稀物种。但由于气候因素和人为因素影响，该地区水域生态系统遭受一定程度的破坏。

研究表明，肠道菌群的结构和数量受多种因素的影响，包含食物组成、环境因素、生理状态和遗传因素等[19-22]，进而影响机体的营养吸收、消化代谢、免疫调控等。该研究充分发挥了16 S扩增子测序平台NovaSeq PE 250的优势，高效避免了不可培养菌群的不可测性，最大限度的测量了肠道菌群的结构和丰度，深入剖析了螭霖鱼肠道共生微生物的多样性并对部分共生微生物的功能，为研究螭霖鱼共生细菌与宿主之间的相互关系以及今后鱼类资源的安全开发与利用提供科学依据。

通过螭霖鱼肠道微生物群落结构与组成多样性，可以发现其群落结构和组成相似，无显著差异，并且群落结构的进化较为稳定；但螭霖鱼肠道微生物结构与其他鱼类，如鲤、草鱼、鲢、团头鲂等有显著差异，这可能与其独特的生存环境、摄食种类、生活习性有关。该试验中样品中提取到的螭霖鱼肠道微生物在高丰度菌群组成上是一致的，但在低丰度菌群中，其组成具有较大差异，提示高通量测序对螭霖鱼不同生物重复中高丰度菌群的组成上具有很好的重复性，但在低丰度菌群上尚需进一步研究。