非酒精性脂肪性肝病患者血清维生素D水平及其受体基因Bsm I位点多态性分析

胡 峦 李 艳 钟伟传 李镇武

1.深圳市龙华区人民医院全科门诊 （广东 深圳，518109） 2.深圳市龙华区人民医院检验科

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）全球发病率约为25.24%，且随着生活水平的不断提高及饮食结构、生活习惯的改变，发病率呈上升且逐渐年轻化的趋势［1-3］。NAFLD是一种可逆性肝病，若能早发现、早诊断及早治疗，可预防甚至控制NAFLD的发生或发展［4-6］。NAFLD病因十分复杂，发病机制目前尚未完全明确，诊断金标准是肝穿刺活检，但创伤性强，不利于病情随访及疗效的判断［7］。因此，阐明NAFLD发病机制及寻找特异性临床诊断标记物，对NAFLD早期诊断、病情评估、疗效判断及预防具有重要意义。本研究对NAFLD患者和健康人群血清25-羟维生素D3［25-（OH）VitD3］水平及其受体（VDR）基因Bsm I位点多态性进行了调查，报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2017年3月至2019年6月来我院就诊并确诊为NAFLD的患者132例，其中男87例，女45例；年龄21～63岁，平均（37.52±13.27）岁；其中轻度69例、中度42例、重度21例。同时选择健康人群120例，其中男80例，女40例；年龄20～65岁，平均（36.23±11.97）岁。两组均排除高血压、高血脂、糖尿病、自身免疫性肝病、病毒性肝炎、药物性肝炎、肝硬化、肾功能不全、心脑血管疾病、肝功能异常及长期每日饮酒量乙醇量男性＞80 g、女性＞40 g者，并确保两组患者的一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经同医院伦理委员会同意批准，并经同患者及家属知情同意，签定知情同意书。

1.2 NAFLD诊断标准及严重程度判断 参照2010年中华医学会肝病学组分会脂肪肝和酒精性肝病学组编著的《NAFLD诊疗指南》［8］。根据肝脏多普勒彩色超声结果判断NAFLD病情严重程度［9，10］：①肝区近场回声弥漫性增强（强于肾脏与脾脏），远场回声逐渐衰减；②肝内管道结构显示不清；③肝脏轻至中度肿大，边缘角圆钝；④肝内彩色血流信号减少或不易显示，但肝内血管走向正常；⑤肝右叶包膜及横幅回声显示不清或不完整。具有①项和②～④项中任何一项者为轻度脂肪肝，具有①项和②～④项中任何两项者为中度脂肪肝，具有①项和②～④项中任何两项及⑤项者为重度脂肪肝。

1.3 仪器与试剂 c8000全自动化学发光分析仪、试剂、校准品及室内质控品均由美国雅培公司提供；ABI7500 PCR基因扩增仪由美国ABI公司提供；DNA提取试剂由深圳亚能生物技术有限公司提供；25-（OH）VitD3试剂盒由索灵诊断医疗设备（上海）有限公司提供。

1.4 方法

1.4.1 标本采集 所有研究对象均于清晨空腹采集4～5 ml静脉血，其中2 ml加入EDTA-K2抗凝管内混匀用于全血DNA提取用，剩余的加入一次性无抗凝剂的干燥管内，室温静置30 min后于离心分离血清，用于25-（OH）VitD3检测。

1.4.2 25-（OH）VitD3水平测定 25-（OH）VitD3采用c8000全自动化学发光分析仪进行检测，所有操作均严格按照c8000分析仪和试剂说明书及科室内SOP操作规程进行。

1.4.3 全血DNA提取 采用深圳亚能生物技术有限公司提供的试剂盒提取全血中DNA，所有操作均严格按照试剂盒及仪器说明书进行，提取后采用紫外分光光度仪检测其浓度和纯度，合格后置于-20℃保存备用。

1.4.4 VDR基因Bsm I位点多态性分析 ①引物设计：上游引物5′-CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA-3′，下游引物5′-AACCAGCGGAAGAGGTCAAGGG-3′。②RCR扩增反应体系：反应总体积为30μl，其中DNA模板4.5μl，10μmol／L上、下游引物各1.5μl，2×Taq PCR Mix 15μl，去离子水7.5μl。③PCR扩增条件：94°C预变性2min，然后以94°C变性30 s→60°C退火30 s→72°C延伸1 min，循环35次，最后72°C延伸2 min。④PCR扩增产物电泳：取PCR产物10μl，加入Bsm I快速内切酶1μl，10×FastDigest Buffer2μl，去离子水17μl，37°C水浴5 min进行酶切，65°C水浴5 min终止反应。然后将酶切产物加入2%的琼脂糖凝胶电泳，于紫外凝胶成像系统下观察条带。⑤判断标准：于650bp和175bp处同时出现2条带的为bb基因型，仅于825bp处出现—条带的为BB基因型，于825bp、650bp和175bp处出现3条带的为Bb基因型。

1.5 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件对所测数据进行统计分析，计量资料采用±s表示，两组间比较采用t检验，计数资料采用率（%）表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种人群血清25-（OH）VitD3水平比较 NAFLD患者血清中25-（OH）VitD3水平为（31.75±9.64）nmol／L，明显低于健康对照组的（60.58±16.93）nmol／L，差异有统计学意义（t＝3.8254，P＜0.05）。

2.2 不同程度NAFLD患者血清25-（OH）VitD3水平比较 重度NAFLD患者血清中25-（OH）VitD3水平为（18.15±4.94）nmol／L，明显低于中度的（29.01±5.73）nmol／L和轻度的（39.56±12.07）nmol／L，差异有统计学意义（t＝2.9752～4.0852，P＜0.05），且25-（OH）VitD3水平随NAFLD病情的加重而逐步降低，经Spearman分析，两者呈正相关（r＝0.7902，P＜0.05）。

2.3 两种人群VDR基因Bsm I位点多态性比较 经2%琼脂糖凝胶电泳，VDR基因Bsm I位点分别于825 bp、650 bp及175 bp处显色检出BB、Bb及bb 3种基因型带，结果见图1，见表1。

1、4为BB基因型；2、6为bb基因型；3、5为Bb基因型；M为标准标记物

表1 两种人群VDR基因Bsm I位点基因型及等位基因检出率比较 ［n（%）］

2.4 不同基因型NAFLD患者血清25-（OH）VitD3水平比较 携带VDR基因Bsm I位点bb基因型的NAFLD患者血清中25-（OH）VitD3为（18.62±5.16）nmol／L，明显低于BB和Bb基因型的（43.29±12.84）nmol／L和（34.05±11.27）nmol／L，差异有统计学意义（t＝3.2193～4.0264，P＜0.05）。

3 讨论

NAFLD发病机制十分复杂，研究表明，NAFLD的发生和发展与胰岛素抵抗、脂质氧化、氧化应激、脂质代谢紊乱、免疫反应、细胞内毒素及基因多态性等诸多因素有密切关系，其中基因多态性突变在NAFLD 发生和发展中发挥着重要的作用［11，12］。因此，探索NAFLD患者基因多态性突变对预防、治疗、降低并发症及病死率至关重要。

维生素D是一种具有激素样作用的脂溶性类固醇物质，主要通过食物摄入或／和紫外线照射下皮肤合成两种途径获取［13］。维生素D除了调节钙、磷代谢外，还参与糖脂代谢、胰岛素合成和分泌、炎性反应、免疫及肿瘤等多种疾病的发生和发展。25-（OH）VitD3是维生素D的主要存在形式，其含量的高低直接反映人体维生素D储存水平。有研究表明，NAFLD患者血清中25-（OH）VitD3水平明显下降，且与NAFLD病情严重程度成正相关［7］。本研究结果显示，NAFLD患者血清中25-（OH）VitD3水平明显低于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），且与病变程度呈正相关，与何周桃等［7］及俞媛洁等［14］报道一致，这可能与25-（OH）VitD3水平降低引起体内糖脂代谢紊乱，使大量脂肪在肝细胞中沉积及脂肪酸氧化作用受抑等有关。

VDR是一种重要的基因转录调节蛋白，其基因位于12q13，由9个外显子和8个内含子组成，存在多个限制性内切酶酶切位点，在人体内分布广泛，可以通过对25-（OH）VitD3产生介导效应进一步发挥其生物学效应，能够维持骨代谢、免疫调节、细胞分化及内分泌平衡［15-17］。有研究表明，VDR基因Bsm I位点多态性发生基因突变能影响人体内25-（OH）VitD3的合成和分泌，导致机体脂质代谢和内分泌紊乱，与多种疾病如骨质疏松症、结核病、前列腺癌、牙周炎及NAFLD等的遗传易感性有关［18-21］。本研究结果显示，NAFLD患者血清中VDR基因Bsm I位点的bb基因型和b等位基因检出率明显高于健康对照组，与何周桃等［7］报道一致。且携带bb基因型的NAFLD患者血清中25-（OH）VitD3水平明显低于其他基因型，这表明了VDR基因Bsm I位点多态性突变与NAFLD的发生和发展有关，其中bb基因型可能是本地区NAFLD发病的危险易感基因之一，这可能与VDR基因Bsm I位点的bb基因型通过影响VDR mRNA的转录，抑制25-（OH）VitD3合成、分泌及其功能有关。

综上所述，NAFLD患者血清中25-（OH）VitD3水平明显下降，并随着病情加重而降低，与病情严重程度呈正相关。VDR基因Bsm I位点多态性突变与NAFLD的发生和发展中有关，其中bb基因型可能是引起NAFLD发病的危险易感基因之一，但不同地区和种族人群的遗传基因突变因遗传背景、生活方式及环境等诸多因素的不同而存在一定的差异。因此，加强VDR基因Bsm I位点多态性突变调查分析，对诊断、治疗及预防NAFLD有重要意义。