非受体酪氨酸激酶BMX对宫颈癌C-33 A细胞成球能力的影响

李媛媛,宫小勇,代引海,杨文婷,郑鹏生

(1.陕西中医药大学第二附属医院,陕西 咸阳 712000;2.西安交通大学第一附属医院,陕西 西安 710061)

宫颈癌(CC,cervical cancer)是一种严重威胁女性健康的恶性肿瘤。目前,宫颈癌的发病率及死亡率在全球妇女恶性肿瘤中仅次于乳腺癌、肺癌和结直肠癌,居第四位[1]。据2015年数据统计显示,我国宫颈癌大约有11.1万新生病例,3.4万死亡病例,且呈现年轻化趋势[2]。人乳头瘤病毒(HPV,human papillomavirus)持续感染作为宫颈癌的首要病因已得到肯定,但是其发病的原因及机制尚不明确[3]。Huang等[4]假设宫颈癌是由感染HPV的宫颈口过渡区的类干细胞形成的,连接/过渡区可能是宫颈癌干细胞的一个可能生态区。目前使用的或潜在的宫颈癌干细胞候选标记物有ABCG2、ALDH1、CD49f、OPN、CD133、OCT4、SOX2等[4-6]。

BMX(bone marrow X-linked kinase,也称Etk)是Tec家族非受体酪氨酸激酶的一种,Tec家族激酶在哺乳动物中有5个组成成员:Btk、Bmx、Itk、Tec和Txk。BMX主要在大动脉内皮组织、胎儿心内膜、成人左心室心内膜、骨髓、肺、淋巴造血细胞等中表达,在炎症、心血管及恶性肿瘤等疾病中起到重要作用[7]。BMX的异常表达参与肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭与转移、血管生成等方面的调控,与肿瘤细胞恶性生物学行为密切相关[8-10]。Guryanova等[11]证实BMX可以在恶性胶质瘤干细胞(GSCs,glioblastoma stem cells)中特异性表达,通过激活STAT3来维持恶性胶质瘤细胞的自我更新和致瘤潜能,有望作为恶性胶质瘤治疗的新靶点。但是BMX对宫颈癌肿瘤细胞的干性特征还未见报道,研究通过成球实验探索BMX对宫颈癌C-33 A细胞干性特征的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料及试剂

DMEM培养基(GIBCO,美国),胎牛血清(FBS,HyClone,美国),青霉素、链霉素(Sigma,美国),胰酶(Amresco,美国),DMSO(Sigma,美国),培养皿(10 mm,BD,美国),牛血清白蛋白(BSA,Sigma,美国),Transwell小室(Corning,美国),基质胶(BD,美国),N2和B27添加剂(Invitrogen,美国)、人重组表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(PeproTech公司,美国),脂质体LipofectamineTM2000(Invitrogen,美国),G418(Calbiochem,德国),限制性内切酶(Takara,日本),T4连接酶(Promega,美国)。

1.2 研究方法

(1) 细胞培养 宫颈癌细胞株HeLa、SiHa、C-33 A均购自美国模式培养物集存库(ATCC,american type culture collection)细胞库,采用DMEM高糖培养基,加10%胎牛血清(FBS),放入37 ℃,含5% CO2的培养箱中培养。

(2) BMX过表达克隆株的筛选 从pcDNA3.1-BMX wt(黄奇英教授赠送,阳明大学)质粒中提取BMX cDNA片段;利用引物进行PCR扩增,引物片段包括BMXF:5′-CGCGTCGACATGGATACAAAATCTATTCTA-3′;BMXR:5′-CTAGGTACCTCAATGCTTGTCTTTTTCCCG-3′;1%琼脂糖凝胶鉴定,胶回收,获得BMX cDNA片段;将BMX cDNA片段插入pCAG-IRES2-AcGFP1-neo载体中,T4连接酶连接,转化,挑单克隆,DNA测序,正确质粒载体标记为pCAG-BMX-IRES2-AcGFP1-neo,-80 ℃保存。

参照LipofectamineTM2000说明书,将BMX过表达DNA质粒转染至C-33 A细胞,24 h后,按照1∶10比例接种到10 cm培养皿中,500 μg/mL G418完全培养基进行阳性克隆筛选,10～14 d后,挑单克隆,Western blot鉴定。

(3) 细胞成球实验 取对数生长期细胞,消化,用DMEM/F12培养基清洗一遍,弃上清,干细胞培养液(DMEM/F12作为基础培养基,添加N2、B27、20 ng/mL EGF和20 ng/mL bFGF)重悬,按照1个细胞每孔的密度接种至96孔板中,每孔120 μL,每隔1 d添加20 μL干细胞培养液。记录肿瘤球在2周内的情况,球径大于50 μm的球体纳入计数范围。

(4) 数据统计学分析 资料经统计软件GraphPad Prism V5.01分析,结果都以均值±标准差(Mean±SEM)展示,两组之间单因素分析采用t检验,P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 BMX在宫颈癌细胞系中的表达

利用免疫细胞化学及Western blot方法检测BMX在宫颈癌细胞系HeLa、SiHa、C-33 A、HT-3及CaSki中的表达。免疫细胞化学染色显示,BMX主要在细胞浆中表达,在细胞核中也有部分表达;BMX在HeLa、SiHa、HT-3及CaSki细胞系中高表达,而在C-33 A细胞中低表达(见图1,上一排为阴性对照,下一排为阳性染色)。Western blot检测也得出同样的结果(见图2)。

图1 免疫细胞化学检测BMX在宫颈癌细胞系中的表达(100×)Fig.1 Immunocytochemistry was used to detect the expression of BMX in cervical cancer cell lines (100×)

2.2 过表达细胞株的获得

在C-33 A细胞中转染对照及过表达BMX质粒载体,G418筛选,挑克隆,Western blot鉴定,结果见图3。C-33 A阴性对照及阳性过表达BMX克隆细胞形态见图4。

图2 Western blot检测BMX在宫颈癌细胞系中的表达Fig.2 Western blot detecting BMX expression in cervical cancer cell lines

2.3 BMX过表达对C-33 A细胞成球能力的影响

对照组(C-AcGFP)与BMX过表达组(C-BMX)的C-33 A细胞在干细胞培养液培养2周后,成球形状及大小见图5。与对照组相比,过表达组球体较为密实,边界较整齐,球径较大。统计分析结果显示:对照组和过表达组细胞成球率无明显差异(见图6,P>0.05),但是过表达组球体直径明显大于对照组(见图7,P<0.001)。因此,总体来讲,过表达BMX可以促进宫颈癌C-33 A细胞的成球能力。

图3 Western blot鉴定BMX过表达克隆细胞株Fig.3 Western blot detecting BMX hyoerexpression clone cell strains

图4 BMX对照及过表达克隆株的细胞形态Fig.4 Morphology of clone cell strains in BMX control group and hyperexpression group

图5 对照组和BMX过表达组成球形状及大小(100×)Fig.5 Sphere shape and size in control group and BMX overexpression group (100×) Figure

图6 统计分析对照组和过表达组细胞成球率(#P>0.05)Fig.6 Statistical analysis of pelletization rate of control group and overexpression group (#P>0.05)

图7 统计分析对照组和过表达组细胞成球球径 大小(***P<0.001)Fig.7 Statistical analysis of sphere diameter in control group and overexpression group (***P<0.001)

3 讨论

Guryanova等[11]探讨了BMX在恶性胶质瘤干细胞(GSCs)中特异性表达,shBMX干扰及显性负向BMX(BMX-DN)可以显著降低胶质瘤干细胞肿瘤球形成的数量及大小。研究中,我们探索了非受体酪氨酸激酶Etk/BMX对宫颈癌细胞C-33 A细胞成球能力的影响,对照组球体较为松散,而过表达组球体较为密实,边界整齐,球径较大(见图5)。统计分析结果显示:对照组和过表达组细胞成球率无明显差异(见图6,P>0.05),主要原因可能是C-33 A转染质粒后对照组与过表达组细胞克隆差异较大(见图1),C-33 A亲本细胞有的是梭形,有的是圆形;转染后(见图4),对照组细胞克隆株形态和亲本相似,3个克隆株导致标准差大,而转染过表达BMX质粒后克隆细胞整体变小,细胞较圆,连接紧密,克隆株个体差异小,因此成球能力较为稳定;但是过表达组球体直径明显大于对照组(见图7,P<0.001)。因此,总体来讲,过表达BMX后肿瘤细胞成球能力明显提高。