香青兰总黄酮对心肌缺血再灌注损伤大鼠mTOR信号通路及相关自噬蛋白水平的影响

梁自强，邓洁，袁勇，马晓莉，郭新红，黄川生，曹文疆*

(1石河子大学药学院，新疆 石河子 832002；2 石河子大学医学院第一附属医院，新疆 石河子 832008)

心肌缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)会严重影响缺血性心脏疾病患者的预后，甚至会进一步诱发严重并发症而致死。研究MIRI的发生机制及防治药物是近年来研究热点之一。

自噬是MIRI的重要机制之一[1-2]。AMPK/mTOR和PI3K/AKT/mTOR是细胞内经典的自噬通路，其通过清除细胞内受损细胞器，如线粒体等，从而实现细胞器更新及自我新陈代谢。腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞能量代谢中起到了重要作用，被称为细胞中的“能量调节器”[3-5]。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)蛋白家族在很多生理活动中起到了重要的的调节作用。AKT,亦称为蛋白激酶B(PKB)，是PI3K下游主要的效应物，主要调控细胞能量代谢，糖代谢，细胞自噬等。mTOR是AMPK和AKT下游蛋白，雷帕霉素靶蛋白(mTOR)参与心肌缺血再灌注损伤的自噬调控过程，mTOR的抑制可激活自噬水平。研究自噬与AMPK/mTOR和PI3K/AKT/mTOR信号通路的作用机制对心肌缺血再灌注损伤大鼠的心肌保护具有重要作用[6-7]。

课题组前期研究结果表明，香青兰总黄酮(DracocephalumMoldavicaL.total flavonoids,TFDM)能明显降低自噬蛋白 LC3和Beclin1的表达抗心肌缺血再灌注损伤，其机制可能与TFDM调控AMPK/mTOR和PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制细胞自噬水平有关[8-10]。因此，通过研究TFDM预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤中的自噬作用，为香青兰总黄酮防治MIRI提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

SPF级健康雄性SD大鼠，体重230～280 g，新疆地方病研究所提供。合格证号：新医动字第2004-0006号。实验操作均符合医学伦理学标准。

1.2 药物与试剂

香青兰总黄酮提取物(TFDM，由新疆自治区药物研究所提供，纯度为57%，20141008)；乌拉坦麻醉药(武汉远城科技公司，20151106)；Rapamycin(APExBIO，10 mg，DMSO溶解)；Compound C(APExBIO，5 mg，DMSO溶解)；LY294002(APExBIO，5 mg，DMSO溶解)；Anti-AMPKα 1 + α 2 (abcam,ab80039)；Anti-p-AMPK α 1 + α 2 (abcam,ab133448)；Anti-mTOR (CST,#2972)；Anti-p-mTOR (CST,#2971)；Anti-AKT (abcam,ab179463)；Anti-p-AKT (abcam,ab81283)；Anti-Bcl-2 (abcam,ab59348)；Anti-LC3 (abcam,ab48394)；Anti-Beclin1 (abcam,ab207612)；Anti-GAPDH(武汉三鹰，60004-1-lg)。

1.3 主要仪器

HX-300呼吸装置(成都泰盟科技公司)；XL-200低速离心仪器(海门其林贝尔仪器厂)；Pico-17台式低温离心机(USA)；立式-80 ℃冰箱(青岛海尔仪器有限公司)；EM-UC6超薄型切片仪器(美国徕卡公司)；千分之一电子天平(奥豪斯上海贸易公司)；VE-180垂直电泳及电转仪(上海天能)；Bio-Rad凝胶成像系统(美国Bio-Rad)；脱色摇床仪(海门其林贝尔公司)；恒温电热培养箱(上海齐欣仪器公司)。

1.4 方法

1.4.1 动物分组及给药

48只雄性SD大鼠，随机划分为6组。①假手术组(Sham)，生理盐水灌胃；②模型组(IR)，生理盐水灌胃；③香青兰总黄酮给药组(TFDM)，香青兰总黄酮60 mg·kg-1·d-1灌胃；④香青兰总黄酮联合mTOR抑制剂Rapamycin组(TFR)，再灌注前30 min腹腔注射2 mg·kg-1的雷帕霉素；⑤香青兰总黄酮联合AMPK抑制剂Compound C组(TFC)，再灌注前30 min腹腔注射500 μg·kg-1的Compound C；⑥香青兰总黄酮联合PI3K抑制剂LY294002组(TFL)，再灌注前30 min腹腔注射300 μg·kg-1的LY294002。

注：手术前7 d及再灌注前10 min给与香青兰总黄酮预处理，再灌注前10 min给药是通过腹腔注射的方式。

1.4.2 大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的建立及取材[11-12]

将大鼠用 25% 乌拉坦(5 mL·kg-1)麻醉后，仰卧位固定。首先进行气管插管，开胸后，立刻连接呼吸机。自制掏环将心脏掏出，迅速结扎左冠状动脉前降支，结扎完成后立刻让心脏回位。缺血 30 min 后，剪断结扎线，再灌注2 h。再灌注结束后，迅速剪取心脏，将其置于冰生理盐水中，轻柔洗净心腔内血液，取左心室壁组织-80 ℃保存备用。

1.4.3 大鼠肌梗死面积的测定

1%的2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2、3、5-Triphenyte-trazolium chloride，TTC)染色法测定心肌梗死面积。再灌注结束后，各组大鼠心脏于 -80 ℃ 冰冻1 h后，平行切成 5～6片1～2 mm的薄片，然后将切片置于 1% TTC 染液中，37 ℃ 避光染色30 min，使之与 TTC 染液充分接触，PBS 冲洗切片 3 次后，将切片置于 10% 甲醛溶液中固定 12 h，增强颜色对比。非梗死心肌组织呈现砖红色，梗死心肌组织呈现灰白色。采集图像，用图像分析软件 Image J 进行处理。

IS为梗死面积(infarct size)，AAR为心肌缺血危险区面积(area at risk)。心肌梗死面积(IS/AAR)/%=(梗死面积之和/全心面积)×100%。

1.4.4 大鼠心肌组织病理学形态检查

苏木精 & 伊红(Hematoxylin & eosin，H & E)染色法观察心肌组织病理学形态变化，苏木精将核酸染为紫蓝色；红色为伊红染色。取心尖及左心室壁进行石蜡包埋，切片。将样本过二甲苯及梯度酒精进行脱蜡及水化，苏木精染色3 min，1%盐酸酒精分化30 s，0.5%伊红染色10～15 s，然后依次过梯度酒精和二甲苯进行脱水，通风橱中晾干，用中性树胶封片，待中性树胶凝固后，显微镜下观察拍照(×200)。

1.4.5 大鼠心肌组织自噬蛋白表达的测定

再灌注结束后，取心肌组织80 mg，用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液提取总蛋白，将蛋白在10%SDS-PAGE上分离，然后转移至PVDF膜(美国密理博)。将膜用TBST或BSA在25 ℃封闭1 h，在4 ℃与一抗孵育过夜(GAPDH、LC3、Beclin1、 Bcl-2、mTOR、P-mTOR、AMPKα1 +α2、p-AMPKα1 +α2、AKT和p-AKT的稀释比例分别为1∶5000、1∶500、1∶2000、1∶2000、1∶000、1∶1000、1∶2000、1∶2000、 1∶1000、 1∶1000)，然后在25 ℃与HRP偶联的二抗孵育1 h。最后，通过Image J软件(美国马里兰州国立卫生研究院)对条带进行分析。GAPDH被用作内部参考。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 香青兰总黄酮对大鼠心肌梗死面积的影响

正常心肌组织染色呈现砖红色，而心肌梗死组织多为苍白色。结果表明，与假手术组相比，模型组心肌梗死面积显著升高(P<0.001)。与模型组相比，TFDM组心肌梗死面积明显减少(P<0.001)，差异具有统计学意义。与TFDM组相比，香青兰总黄酮联合mTOR抑制剂、AMPK抑制剂及PI3K抑制剂组均使心肌梗死面积明显增加(P<0.001)，说明香青兰总黄酮对心肌的保护作用被抑制剂所抵消(图1)。

TFR：TFDM联合mTOR抑制剂Rapamycin组；TFC：TFDM联合AMPK抑制剂Compound C组；TFL：TFDM联合PI3K抑制剂LY294002组。 与sham组相比，***P<0.001；与I/R组相比，###P<0.001；与TFDM组相比，&&&P<0.001。图1 香青兰总黄酮对大鼠心肌梗死面积的影响

2.2 香青兰总黄酮对大鼠心肌组织病理学形态的影响

假手术组心肌纤维排列整齐，界限清晰，呈束状分布，细胞核形态规则，分布匀称；模型组心肌纤维排列紊乱，横向条纹消失，心肌细胞炎症浸润，细胞肿胀破裂，坏死，细胞核变形移位；香青兰总黄酮明显改善了上述症状，而香青兰总黄酮联合mTOR抑制剂、AMPK抑制剂及PI3K抑制剂组，香青兰总黄酮的保护效应消失，表明抑制剂均可以不同程度的抑制香青兰总黄酮的保护效应(图2)。

TFR：TFDM联合mTOR抑制剂Rapamycin组；TFC：TFDM联合AMPK抑制剂Compound C组；TFL：TFDM联合PI3K抑制剂LY294002组。图2 香青兰总黄酮对大鼠心肌病理学形态的影响(HE染色×200)

2.3 香青兰总黄酮对大鼠心肌LC3、Beclin1以及Bcl-2蛋白表达的影响

与Sham组相比，模型组LC3以及Beclin1的蛋白水平明显升高，Bcl-2的蛋白水平明显降低，差异存在统计学意义(P<0.001)；与模型组相比，TFDM组LC3(P<0.05)以及Beclin1(P<0.01)的蛋白水平降低，Bcl-2的蛋白水平升高(P<0.05)；与TFDM组相比，TFDM联合mTOR抑制剂Rapamycin组LC3(P<0.01)的蛋白水平降低，TFDM联合mTOR抑制剂、AMPK抑制剂以及PI3K抑制剂组Beclin1蛋白水平均不同程度的升高(P<0.05)，Bcl-2的蛋白水平明显降低。

说明香青兰总黄酮可抑制大鼠心肌LC3以及Beclin1蛋白的表达，上调Bcl-2的蛋白表达，降低细胞自噬水平，提高抗凋亡能力保护心肌。但是，香青兰总黄酮对心肌的保护作用均被抑制剂所抵消，表明mTOR、AMPK以及AKT参与香青兰总黄酮对心肌细胞的保护作用(图3)。

TFR：TFDM联合mTOR抑制剂Rapamycin组；TFC：TFDM联合AMPK抑制剂Compound C组；TFL：TFDM联合PI3K抑制剂LY294002组。 与sham组相比，***P<0.001；与I/R组相比，#P<0.05，##P<0.01；与TFDM组相比，&P<0.05，&&P<0.01。图3 香青兰总黄酮对LC3、Beclin1及Bcl-2蛋白表达的影响

2.4 香青兰总黄酮对大鼠心肌mTOR、AMPK及AKT蛋白表达的影响

与Sham组相比，模型组p-mTOR(P<0.01)、p-AMPK(P<0.001以及p-AKT(P<0.01)蛋白水平明显降低；与模型组相比，香青兰总黄酮升高了p-mTOR(P<0.05)、p-AMPK(P<0.001)以及p-AKT(P<0.05)蛋白水平；与TFDM组相比，TFDM联合mTOR抑制剂组p-mTOR蛋白表达下降(P<0.05)，TFDM联合AMPK抑制剂组p-AMPK表达下降(P<0.001)，TFDM联合PI3K抑制剂组p-AKT表达下降(P<0.01)，说明抑制剂的使用是成功的。抑制剂组p-mTOR、p-AMPK和p-AKT的表达均不同程度的降低，其中TFDM联合AMPK抑制剂组p-mTOR水平升高，与TFDM相比无显著性差异，表明香青兰总黄酮能调控AMPK/mTOR和PI3K/AKT/mTOR信号通路调节细胞自噬水平(图4)。

TFR：TFDM联合mTOR抑制剂Rapamycin组；TFC：TFDM联合AMPK抑制剂Compound C组；TFL：TFDM联合PI3K抑制剂LY294002组。 与sham组相比，**P<0.01，***P<0.001；与I/R组相比，#P<0.05，###P<0.001；与TFDM组相比，&P<0.05，&&P<0.01，&&P<0.001。图4 香青兰总黄酮对mTOR、AMPK及AKT蛋白表达的影响

3 讨论

大鼠在心肌缺血再灌注损伤过程中，心肌组织明显受损，其中心肌梗死面积是评价心肌损伤的重要指标[7，13]，本研究采用香青兰总黄酮持续给药7天，结扎大鼠冠状动脉左前降支缺血30 min，再灌注2 h建立心肌缺血再灌注损伤模型。结果显示，与模型组相比，香青兰总黄酮能显著降低大鼠心肌梗死面积。组织病理学的实验结果表明香青兰总黄酮能明显改善大鼠心肌组织病理学损伤，对MIRI大鼠具有明显的保护作用。香青兰总黄酮联合mTOR抑制剂、AMPK抑制剂及PI3K抑制剂组，香青兰总黄酮的保护作用被抑制，香青兰总黄酮对MIRI的保护作用与AMPK/mTOR和PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。

自噬是以细胞内出现自噬体为标志的细胞自我消化过程，多种自噬相关基因参与心肌缺血再灌注损伤的发生、发展过程。LC3及Beclin1是自噬过程中重要的蛋白，随着自噬程度的不断加重而升高。其中，LC3是自噬标志性分子，Beclin1可以介导自噬体膜的形成。Bcl-2是一种重要的抗凋亡蛋白，随着心肌损伤的加重而不断降低[14-15]。因此，降低LC3及Beclin1蛋白表达，升高Bcl-2蛋白表达是保护心肌缺血再灌注损伤重要手段。结果显示，与模型组相比，香青兰总黄酮降低了LC3II/LC3I的比值及Beclin1蛋白表达，上调了Bcl-2蛋白的表达，表明香青兰总黄酮可抑制细胞自噬，减弱细胞凋亡。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)一直被认为是自噬的负调控因子，在MIRI诱导的自噬过程中，mTOR 的活性随自噬的加重而不断减少。mTOR是AMPK和AKT下游蛋白[16-18]，AMPK/mTOR及PI3K/AKT/mTOR信号通路为自噬调控中的抑制性通路，在自噬调节中发挥重要作用，研究自噬与AMPK/mTOR及PI3K/AKT/mTOR信号通路在MIRI过程中的作用机制具有重要意义。本研究结果显示，模型组中心肌细胞内p-mTOR、p-AMPK及p-AKT蛋白表达明显降低，香青兰总黄酮升高了p-mTOR、p-AMPK及p-AKT蛋白表达。然而，TFDM联合mTOR抑制剂、AMPK抑制剂组及PI3K抑制剂组p-mTOR、p-AMPK和p-AKT的表达均不同程度的降低，提示抑制剂干预后AMPK/mTOR及PI3K/AKT/mTOR信号通路的表达被抑制，自噬增强，香青兰总黄酮对心肌的保护作用被抑制剂所抵消。其中TFDM联合AMPK抑制剂组p-mTOR的表达升高，但与TFDM相比无显著性差异，表明对mTOR的调控过程中PI3K/AKT/mTOR信号通路可能占主导地位。

本研究结果提示，香青兰总黄酮可以通过激活AMPK/mTOR和PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制自噬，减弱细胞凋亡，从而保护缺血心肌。mTOR是自噬通路的调控中心，在本研究中，我们仅研究了AMPK/mTOR和PI3K/AKT/mTOR信号通路在MIRI的重要作用，它不是香青兰总黄酮发挥心肌保护的唯一机制，因此，未来有更多的工作需要进一步研究。