响应面法优化银叶金合欢组培苗生根培养基条件

武爱龙， 何 冰， 吴建阳， 周鲜娇

(1.湛江幼儿师范专科学校， 广东 湛江 524037； 2.岭南师范学院 基础教育学院， 广东 湛江 524037；3.岭南师范学院， 广东 湛江 524048)

银叶金合欢 (Acaciapodalyriifolia)是豆科金合欢属植物，为常绿大型灌木或小乔木，耐干旱，具根瘤，在全日照、排水良好的环境能快速生长。其花期冬末春初，黄花色系，头状花序，腋生，开花时成簇，形成球状花冠，是一种优良的冬季型观花、观叶及植被恢复、蜂源树种[1]，因而被广泛应用于城乡园林绿地景观多元化提质和风景林景观生态建设中[2]。特别是在我国海南、福建、广东、广西等南方省区将银叶金合欢作为行道树和公园绿化树种种植，具有适应性强、长势良好、观赏效果佳的特点，市场对银叶金合欢种苗的需求量越来越大[3]，而目前优良的种苗主要依靠进口，价格较高[4]。银叶金合欢种苗主要是以播种繁殖和扦插繁殖为主，但播种繁殖因其种子外部具有蜡状角质层，常温下透水性极差，自然状况下发芽率极低；而扦插繁殖又因其单宁含量较高，插条不容易生根[5-7]。因此，利用组培技术快速繁殖培育优良银叶金合欢种苗是重要发展途径。外植体生根是组培苗培育的关键因素，根系的多少、强弱直接影响组培苗的成活率与繁殖效率。组培苗生根培养基的配置受多种因素的影响，仅注重某一因素优化生根培养基较为片面，不利于提高组培苗的生根能力。响应面法可在单因素试验的前提下，通过对各因素与组培苗生根指标的相关性分析建立回归模型，经计算可得到可靠的试验因素优化方案[8-9]。笔者采用响应面法优化银叶金合欢组培苗根系生长条件，以期能筛选出适合银叶金合欢组培苗快速生长的生根培养基配方供繁育组培苗参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验材料为组培室继代保存的银叶金合欢组培幼苗。从幼苗中选取生长健壮，高1.5 cm以上的芽，接种于生根培养基上。

1.2 试验方法与条件

由于生根培养基主要受到培养基激素种类IBA、NAA以及蔗糖添加量的影响，所以前期通过单因素预试验确定各试验因素的范围后，采用响应面分析法优化银叶金合欢生根培养基，利用响应面法确定银叶金合欢生根培养基的最佳条件。选用根数、生根率为响应值，采用Design-Expert 8.0.6软件中的Box-Behnken design 设计原理，在单因素基础上选取IBA浓度(A)、NAA浓度(B)、蔗糖添加量(C)因素为自变量，选取根数(Y1)、生根率(Y2)因为变量，设计3因素3 水平试验(表1)。再利用Design-Expert 8.0.6软件中的RS(response surface)程序分析，应用Model Graph程序作响应面图，获得银叶金合欢组培生根培养基最佳的激素浓度以及蔗糖添加量。

表1 银叶金合欢生根培养基响应面试验因素水平

以上试验以1/2MS为基本培养基，添加琼脂6 g/L，活性炭0.05 g/L，控制pH为6.0，生根培养基均在121℃蒸汽高压灭菌15 min，室内培养温度为26℃，光周期为14 h、光照强度1 500～2 000 lx。每组试验接种10瓶，每瓶10株，3次重复，20 d后调查统计其生根率、生根数。

1.3 数据统计与分析

1.3.1 数据统计

生根率=生根的组培苗数/全部的组培苗数(接种苗数)×100%

每株平均生根数=生根苗的总根数/总生根株数

1.3.2 数据分析与最优验证 利用Design Expert 8.0.6软件对试验数据进行响应面曲线优化分析，由回归方程得到IBA浓度、NAA浓度、蔗糖添加量这3个因素对银叶金合欢生根影响的响应曲面。该图直观的给出了各因素相互作用响应面的 3D 图，根据所拟合的响应面形状，分析各因素对银叶金合欢幼苗生根生长情况的影响，推测出最佳生根培养基的条件。

2 结果与分析

2.1 银叶金合欢组培苗生根生长情况

组培苗芽接入生根培养基培养的第7天后，部分芽苗在切口处开始长出白色圆点；第10天后开始生根，幼根呈现放射状排列，同时幼苗开始生长，叶片变绿；第20天时对生根情况调查发现，没有根的苗基部会形成成块疏松白色愈伤组织，或苗基部切口呈现褐色，而有根的苗根呈乳白色，较粗，部分有侧须根。随着培养时间的延续，生根苗叶片逐渐转绿，根系逐渐伸长，苗也逐渐长高。

2.2 响应面(RSM)试验结果

2.2.1 回归模型的建立与分析 以银叶金合欢组培幼苗根数、生根率为响应值，利用 Design-Expert 8.0.6软件进行二次多元回归拟合，建立模型:

Y1=3.76+0.20A+0.21B+0.19C+0.27AB+0.27AC+0.065BC-0.70A2-0.49B2-0.40C2

Y2=71.51-0.68A+5.91B+4.56C+8.38AB+7.93AC+0.61BC-14.50A2-7.98B2-5.59C2

式中，Y1，Y2分别为银叶金合欢组培幼苗的根数、生根率；A为IBA浓度；B为NAA浓度；C为蔗糖添加量。对回归模型进行方差分析(表2)可知，以根数、生根率为响应值建立的回归模型均极显著(P<0.01)，说明建立的模型有意义；回归模型的失拟项不显著(P>0.05)，说明模型的拟合度良好。此外，对回归方程进行检验，由方差分析结果可知，根数模型的校正决定系数RAdj2=0.967 9，说明该模型能够解释96.79%响应值的变化；生根率的RAdj2为0.859 7；说明以根数、生根率为响应值建立的模型与数据拟合度高，可以采用此回归模型进行银叶金合欢组培苗生根培养基的生根生长情况相关分析与预测。通过回归系数显著性检验(表2)可知，在根数作为响应值中，一次项系数A、B和C的P值均<0.01，表明线性影响效应中A、B和C对银叶金合欢生根培养基的根数影响效应显著，影响银叶金合欢根数的因素主次为NAA浓度>IBA浓度>蔗糖添加量。二次项系数A2、B2、C2的P值均<0.000 1，说明多个具体的试验因子对响应值的影响变化相对复杂，曲面效应极显著，交互项AB、AC交互效应P<0.01，效应极显著，BC交互效应不显著。

表2 响应面二次多项式模型及回归系数的方差分析

在生根率作为响应值中，一次项系数B(NAA)的P值为0.009 5,P<0.01和C(蔗糖添加量)的P值为0.029 3，P<0.05，表明线性影响效应中B(NAA浓度)和C(蔗糖添加量)对银叶金合欢生根培养基的根数影响效应显著，而A(IBA浓度)对银叶金合欢生根培养基的根数影响效应不显著，影响银叶金合欢生根培养基根数的因素主次为NAA浓度>蔗糖添加量>IBA浓度。二次项系数A2、B2、C2的P值均<0.05，说明多个具体的试验因子对响应值的影响变化相对复杂，曲面效应显著，交互项 AB、AC交互效应P<0.05，效应极显著，BC交互效应不显著。

2.3.2 响应曲面的分析与优化 利用 Design-Expert 8.0.5求解回归方程，以银叶金合欢组培幼苗根数、生根率为指标，形成了响应曲面图(图1)，得到适合银叶金合欢最佳生根培养基组合为1/2MS +IBA 0.80 mg/L+ NAA 0.30 mg/L+蔗糖15 g/L +活性炭0.05 g/L+琼脂6 g/L ，此条件下银叶金合欢幼苗根数3.756条，生根率71.506%。

3 结论与讨论

试验以银叶金合欢增殖培养获得的健壮无菌芽为材料，通过调整IBA、NAA、IAA 3种植物调节剂的浓度，筛选出适宜生根的培养基。利用响应面法，评分值作响应值，建立响应面模型，并对其回归方程分析，获得最优培养基条件中 3个因素的加入量为IBA 0.8 mg/L、NAA 0.3 mg/L、蔗糖15 g/L，此条件下银叶金合欢幼苗根数3.756条，生根率71.506%。

研究在前人研究的基础上，以银叶金合欢组培幼苗根数、生根率为响应值，利用Design-Expert 8.0.6软件对中心组合设计所得试验数据获得回归方程，并进行响应曲面法分析，能得到最佳的试验结果，而且这样的结果更具说服力，当然银叶金合欢生根条件的影响因素很多，除研究中的3种因素外还有其他影响因素，如有机添加剂、不同的 pH等还有待进一步深入研究。