稻曲病菌菌株GZ-2中携带的病毒基因组特征

张婷婷， 滕 丽， 蔡小姚， 刘红美*

(1.贵州医科大学 生物与医学工程重点实验室， 贵州 贵阳 550025； 2.贵州医科大学 环境污染与疾病监控省部共建教育部重点实验室， 贵州 贵阳 550025； 3.贵州医科大学 基础医学院， 贵州 贵阳 550025)

真菌病毒(mycovirus或Fungal viruses)是一类感染丝状真菌、蘑菇和酵母并在寄主体内复制与增殖的病毒。1953年，Shope最早在绳状青霉(Penicilliumfuniculosum)中分离得到一种可诱导哺乳动物合成干扰素提高动物抗病毒能力的物质，称为“Helenine”。1962年，真菌病毒被首次报道，英国科学家HOLLINGS[1]在发病的双孢蘑菇(Agaricusbisporus)子实体中发现了球形病毒和短棒状病毒的病毒粒体，通过分离病毒粒体接种到健康的蘑菇，呈现了病害传播的过程，这标志了真菌病毒学的开端。病毒基因组的核酸类型和病毒基因的复制方式是真菌病毒分类的主要依据，目前发现的绝大多数真菌病毒的基因组核酸是双链核糖核酸(double-stranded RNA，dsRNA)。dsRNA病毒主要属于6个科，分别是呼肠孤病毒科(Reoviridae)、全病毒科(Totiviridae)、双分病毒科(Paritiviridae)、产黄青霉病毒科(Chrysoviridae)、四分体病毒科(Quadriviridae)和巨型双节段病毒科(Megabirnaviridae)[2]。然而，近年来越来越多的dsRNA被证明尚未分类[3-5]。

水稻稻曲病(Rice false smut)是由稻曲病菌(有性态：Villosiclavavirens；无性态：Ustilaginoideavirens)侵染造成的一种水稻穗部真菌类病害，病原菌侵染导致水稻小花上形成体积数倍于稻粒的病原菌菌落，即稻曲球[6-7]。近20年来，由于中国水稻肥水施用水平的普遍提高和大穗型品种的大面积推广，稻曲病的发生呈加重趋势，由一个历史上零星、偶发性病害演变成为中国各水稻产区的主要病害之一[8-9]。稻曲病的发生不但对水稻高产稳产造成威胁，同时由于稻曲病菌能够产生大量毒素(Ustiloxins)，对人、动物和植物的细胞分裂具有强烈的抑制作用[10-13]，用稻曲病粒拌饲料喂家兔和当地母鸡，经35～84 d喂养，可引起死亡和内脏器官病变，用带稻曲菌的谷糠喂猪，母猪出现产死胎、干尸胎和畸形胎等症状[8]。因此，对稻米的食用安全和稻田周边食草动物带来潜在的威胁。

2010年代，ZHANG等[14]首次报道了水稻稻曲病菌菌株中携带真菌病毒，关于稻曲病菌中携带真菌病毒报道随之增加[5，15-18]。而笔者从稻曲病菌菌株GZ-2中分离的真菌病毒，病毒命名为UstilaginoideavirensUnclassified virus 2(UvUV2)。对UvUV2的全基因组序列测序和分析，发现UvUV2尚未被分类。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 稻曲病菌菌株GZ-2于2015年从贵州省稻曲病菌侵染的水稻稻曲球中分离。

1.1.2 试剂 氨苄青霉素(Ampicillin；Amp)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，DNA胶回收试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司，2×PCR mix购自北京康润诚业生物科技有限公司，DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司，DNase I酶、S1 Nuclease酶、M-MLV反转录酶、Klenow酶、pMD18-T载体、T4RNA连接酶均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.1.3 仪器与设备 制冰机、电冰箱、电泳仪、培养箱、恒温振荡器、凝胶成像仪、恒温水浴锅、高速离心机、超净实验工作台等。

1.2 稻曲病菌菌株GZ-2的分离

将稻曲球切分成小块，用5%的次氯酸钠将新鲜的稻曲球进行表面消毒1 min，用无菌蒸馏水浸泡3次，随后用75%的酒精表面消毒1 min左右，再用无菌蒸馏水浸泡3次，然后置于无菌离心管中震荡制备成稻曲病菌厚垣孢子的悬浮液，并用无菌蒸馏水将厚垣孢子悬浮液稀释成10倍梯度的孢子液，用移液枪吸取100 μL不同梯度的孢子液，分别涂布于含有100 μg/mL头孢霉素的土豆葡萄糖培养基(Potato Dextrose Agar，PDA)上，置于28℃恒温培养箱中培养，逐日观察分离结果，待长出菌落后，挑取单个菌落。对所有成功分离获得的菌株进行编号，保存于-20℃冰箱中。

1.3 dsRNA的提取及纯化

挑取目标菌株GZ-2，在PDA培养基上培养7～10 d。将菌株GZ-2的菌丝体在液氮冷冻条件下用碾钵研磨成粉末状，装入无菌离心管中。每0.4 g样品中依次加入600 μL 2×GPS、600 μL苯酚(Tris-HCl饱和，pH 8.0)、600 μL氯仿-异戊醇(体积比24∶1)和138 μL 10% SDS，剧烈振荡，使之充分混匀，12 000 r/min、4℃离心10 min。然后取上清液约600 μL，加入0.04 g CF-11纤维素粉末和114 μL无水乙醇，混匀后4℃过夜。然后离心机12 000 r/min离心5 min后弃上清液，倒扣滤纸上吸干残液，移液器加入600 μL清洗缓冲液，混匀后静置1 min；重复洗脱3次后，加入640 μL 1×STE，混合摇匀，12 000 r/min离心8 min并吸取600 μL上清液至新的无菌离心管中，然后取上清液600 μL缓慢移入管中，加入1/10体积的3 mol/L醋酸钠，加入1倍体积的异丙醇，充分混匀后于-20℃冰箱中静置2 h，12 000 r/min、4℃离心30 min，去除上清液，加入500 μL 75%乙醇，振荡无菌离心管，将沉淀弹起，清洗沉淀，12 000 r/min 4℃离心5 min后弃去上清液，用移液枪吸去管底的多余液体，风干沉淀10 min，加入20 μL DEPC-H2O，沉淀溶解完全得到菌株GZ-2中的真菌病毒。用DAaseI(RNase free)和S1核酸酶处理样品，去除样品中的DNA和单链RNA(single-stranded RNA，ssRNA)污染。样品在1%琼脂糖凝胶中电泳，用0.1 μg/mL溴化乙锭染色，紫外下观察UvUV2的条带特征。

1.4 cDNA合成及分子克隆

将纯化的dsRNA样品作为模板，采用FROUSSARD[19]描述的随机引物扩增法获得了UvUV2的随机序列。病毒末端克隆的方法参考POTGIETER等[20]采用的方法，首先在dsRNA的两末端加1段已知序列的接头片段，然后将加上接头的dsRNA进行反转录合成cDNA第1条链，最后用与该序列互补的一段寡核苷酸作为引物，另一引物根据已测定序列设计，进行逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction；RT-PCR)获取dsRNA末端的序列。将扩增的cDNA产物与pMD18-T载体连接，并热激转化大肠杆菌DH5α，鉴定阳性克隆，进行测序分析。

1.5 序列拼接及系统进化分析

测序得到的序列被组装并上传GenBank数据库中，获取的登录号为MH094804。序列拼接、分析和比对使用DNAMAN 7.0和COBALT web服务器(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/cobalt.cgi?link_loc=BlastHomeLink)；序列同源性搜索使用NCBI网站的在线BLAST程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。利用最大相似性法则(maximum-likelihood，ML)进行系统进化树的构建。ML树的计算使用MEGA 5.0软件[21]。

2 结果与分析

2.1 UvUV2的条带类型

水稻稻曲病菌株GZ-2中提取的真菌病毒，经DNaseI和S1核酸酶处理，在1%琼脂糖凝胶电泳检测可见到在3 kbp附近有1条单一的明显的dsRNA条带(图 1)，命名为UstilaginoideavirensUnclassified virus 2(UvUV2)。

2.2 UvUV2中间序列的获取

菌株GZ-2携带的dsRNA经反转录、扩增得到大量随机片段，在琼脂糖凝胶电泳上呈弥散条带(图2)。切下750～1 000 bp的随机片段进行胶回收、连接、克隆，挑选单克隆进行PCR鉴定，结果在1%琼脂糖凝胶上呈大小不一的单一片段(图3)。挑取较大的随机片段进行测序、拼接。

2.3 UvUV2末端序列的获取

UvUV2两末端非编码区结构复杂，不能通过随机片段扩增得到，需在获得UvUV2中间序列的基础上在2个末端加上1个接头引物后反转录成cDNA，另一端再用基于已获取的UvUV2片段，设计特异引物进行PCR扩增才能得到末端序列。扩增得到的末端序列通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，部分结果如图4所示。将目的片段切胶回收经过连接、转化、测序等步骤获得序列。

2.4 UvUV2序列

如图5所示，UvUV2全长2 887 bp，G+C含量为58.8%。通过随机引物扩增法得到UvUV2的随机片段(图5中1～16)，经过DNAMAN 7.0软件进行序列拼接，发现并不能完全拼接出1条完整的全基因序列。随后，根据已获取的基因组序列设计特异性的搭桥引物A和B，通过PCR克隆出未获得的基因组序列，用Potgieter等描述的方法扩增5′和3′末端[22]。最后通过DNAMAN 7.0软件拼接得到1条完整的UvUV2基因组序列。

2.5 UvUV2的全基因组序列

由图6可见，UvUV2含有2个开放阅读框(ORF1和ORF2)。ORF1起始于第10位碱基，终止于第571位的UAG密码子，全长561 bp，编码186个氨基酸(20.06 kDa)；ORF2起始于第431位的AGU密码子，终止于第2 825位碱基，全长2 394 bp，编码797个氨基酸(89.42 kDa)。5′和3′末端非翻译区分别长10 bp和62 bp。通过BlastP比对分析显示，ORF1编码未知蛋白；ORF2编码依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)。2个ORF框重叠340 bp，ORF2可能以融合蛋白的形式与ORF1一起通过+1核糖体移码机制表达。在UvUV2中发现基因组序列(CCC_UUU_UAG563-571)类似于甲型流感病毒基因组中的滑动序列(UCC_UUU_CGU)，通过+1核糖体移码促进融合蛋白的表达(图7)。因此，ORF1和ORF2的融合将产生分子量为104.3 kDa的Gag-Pol融合蛋白。

2.6 系统进化树构建

由图8可见， 22株dsRNA病毒科成员UvUV2的RdRp区域构建系统进化树。UvUV2与Purpureocilliumlilacinumnonsegmented virus 1(PINV-1)、Nigrosporaoryzaenonsegmented RNA virus 1( NoNRV-1)、Leshenaultpartiti-likevirus(LPLV)、Ustilaginoideavirensnonsegmented virus 1(UvNV-1)、 Bryopsis mitochondria-associated dsRNA(BDRM)形成了一个独立的分支，与已分类的氨基酸序列不在一个分支，说明UvUV2与已分类病毒的同源关系较远。UvUV2在基因组组织和序列上与PINV-1、NoNRV-1、LPLV、UvNV-1和BDRM高度相似，和相似性高的5株病毒在一个分类群。推断，UvUV2与5株病毒一样属于未分类病毒，是一种新型真菌病毒，与Partitiviridae家族成员的RdRp有较远的亲缘关系，但与Amalgaviridae科和Totiviridae科的病毒不同。

3 结论与讨论

通过对稻曲病菌菌株GZ-2中携带的真菌病毒 UvUV2的研究，获取了该病毒的全基因组信息，从该病毒的基因组结构分析得知，UvUV2全长2 887个碱基，含有2个开放阅读框(ORF1和ORF2)，ORF1长 561个碱基，BlastP比对结果表明编码未知蛋白，ORF2长2 394个碱基，BlastP比对结果表明编码依赖RNA的 RNA聚合酶(RdRp)。在UvUV2基因组序列(CCC_UUU_UAG563-571)中发现1个类似于甲型流感病毒基因组中的滑动序列(UCC_UUU_CGU)的基因序列，通过+1移码促进Gag-Pol融合蛋白基因的表达。另外，BlastP的同源性搜索表明，UvUV2的ORF1和ORF2与PINV-1、NoNRV-1和UvNV-1共3种未分类病毒编码的蛋白高度相似。综上所述，表明UvUV2属于新型未分类的病毒科。

在很多病毒的基因表达过程中存在一种叫程序性核糖体移码(Programmed Ribosomal Frameshifting；PRF)的蛋白质翻译调节机制，常见的类型包括，+1程序性核糖体移码机制(+1PRF)和-1程序性核糖体移码机制(-1PRF)。目前研究表明，+1PRF机制的产生只需要1个六聚体核糖体移码序列元件(UUU_CGN， N=A，U，G，C)[23]。

在UvUV2基因组序列(CCC_UUU_UAG563-571)中发现了1个类似于甲型流感病毒基因组中的滑动序列(UCC_UUU_CGU)的基因序列，通过+1移码[24]促进PA基因的表达。此外，在预测的滑动序列中，ORF1中存在1个终止密码子(带下划线的CCC_UUU_UAG569-571)，表明其与Closteroviridae[25]家族成员和Euplotes属纤毛原生动物[26]相似，在这些原生动物中，移码发生在“移位停止”移码位点[27]。这些位点由终止密码子组成，前面紧跟着1个光滑的序列，可以允许+1移码(纤毛虫中的AAA和Closteroviridae科某些成员中的UUU)[25-26]。

利用ORF1推导的氨基酸序列进行的BlastP搜索显示，序列与3种未分类病毒编码的蛋白高度相似，即Purpureocilliumlilacinumnonsegmented virus 1(PINV-1)同源性为78%[4]、Nigrosporaoryzaenonsegmented RNA virus 1(NoNRV-1)同源性为53%[28]和Nigrosporaoryzaenonsegmented RNA virus 1(UvNV-1)同源性为40%[5]。根据BlastP分析，ORF2编码的依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)与Purpureocilliumlilacinumnonsegmented virus 1(PINV-1)同源性为78%与Nigrosporaoryzaenonsegmented RNA virus 1(NoNRV-1)同源性为45%和Nigrosporaoryzaenonsegmented RNA virus 1(UvNV-1)同源性为40%。这些数据表明，UvUV2很可能代表了一种感染稻曲病菌的新型dsRNA病毒。虽然UvUV2和UvNV1具有不分段的相似之处，并且具有类似于Totivirus的基因组结构，但其在基因组结构和长度上表现出不同。UvUV2的全序列(2 887 bp)比UvNV1的全序列(3 768 bp)短得多。此外，UvUV2的5′和3′非编码区较短，分别为10 bp和62 bp，而UvNV-1的5′和3′非编码区分别为741 bp和296 bp。因此，可以推测UvUV2是一种新型的、未分类的真菌病毒。