华南忍冬总酚酸提取工艺优化及体外抗氧化活性研究

李 洁,宫路路,王 刚,崔霖芸,刘 亮 ,柳陈坚

(1.遵义医药高等专科学校,贵州遵义 563000;2.遵义医科大学,贵州遵义 563000;3.昆明理工大学,云南昆明 650500)

华南忍冬(Loniceraconfusa)是忍冬科忍冬属半常绿藤本植物,其花是药食两用植物山银花的主要来源之一[1]。华南忍冬具有抗菌消炎、清热解毒的功效[2-3],在临床上主要用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温热发病等症状[4-6]。现已广泛应用于日化、饮料、美容、保健品等领域[7-8]。

酚酸类化合物是华南忍冬的有效成分,主要包括绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸等化合物,《中国药典》2015版将绿原酸规定为山银花质量控制的主要指标[9]。酚酸类化合物具有多种生物活性,主要表现在清除自由基、舒张血管、抗癌、抗病毒、抗菌消炎、抗过敏等方面[10]。

传统提取中药有效成分的方法存在耗时长、效率低、温度较高等问题[11-14]。张忠斌等[15]分别采用改良石硫法、正丁醇萃取法、乙醇回流提取法和水提醇沉法提取金银花中酚酸类成分,发现改良石硫法提取含量最高,达到68.87±1.25 mg/mL,但该方法耗时长且操作繁琐,效率不高;赵佳鑫等[16]采用乙醇回流法提取灰毡毛忍冬总酚酸,其含量为61.716 mg/mL,但该方法的提取温度较高,达到90 ℃。张百霞等[17]采用乙醇回流法,其最佳温度也达到82 ℃。微波提取技术在传统提取工艺的基础上强化传热、传质过程,具有提取速度快、效率高、质量好等特点[18-19]。目前,华南忍冬总酚酸微波辅助提取工艺未见文献报道,故本论文以华南忍冬为原料,运用微波提取法提取华南忍冬总酚酸,并结合单因素和响应面设计优化提取工艺参数,同时通过DPPH自由基清除能力和铁离子还原能力考查华南忍冬提取物体外抗氧化活性,以期为华南忍冬的开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

华南忍冬 购于买绥阳县药材市场,由生药教研室张玉金副教授鉴定为真品;绿原酸标准品 纯度98%，中国药品生物品检定所(生产批号:BW1811);1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 上海浩然生物技术有限公司;槲皮素(QUE)、维生素C(VC) 华中药业股份有限公司;铁氰化钾、三氯化铁、十二烷基硫酸钠、无水乙醇、盐酸、甲醇、乙腈、冰醋酸、三氯乙酸、无水乙酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、槲皮素 均为国产分析纯。

XH-100A型微波催化合成提取仪 北京祥鹄科技发展有限公司;SC-3614型低速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司;DK-98-Ⅰ型电子恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司;AL204型电子天平 上海梅特勒-托利多仪器有限公司;RE-52 型旋转蒸发仪 上海亚荣仪器公司;TU-1901型双光束紫外分光光度计 北京普析通有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 华南忍冬中总酚酸的提取 将准确称取的5.00 g华南忍冬干品放入250 mL的圆底烧瓶中,并添加不同体积的无水乙醇,采用微波辅助提取华南忍冬总酚酸,在设定的功率和温度下加热回流提取一段时间,然后提取液冷却至室温后抽滤,收集滤液至500 mL容量瓶中,加无水乙醇定容,并放置于冰箱保存备用。

1.2.2 单因素实验 以乙醇浓度、液料比、提取温度、提取时间和微波功率5个条件为研究对象,以华南忍冬中总酚酸含量为考察指标。

1.2.2.1 乙醇浓度对华南忍冬总酚酸含量的影响 设定微波功率为400 W,微波提取时间为30 min,温度70 ℃,液料比12∶1 mL/g,分别在乙醇浓度为20%、40%、60%、80%、100% 5个梯度下,研究乙醇浓度对华南忍冬总酚酸含量的影响。

1.2.2.2 提取温度对华南忍冬总酚酸含量的影响 设定微波功率400 W,提取时间30 min,乙醇浓度为80%,液料比12∶1 mL/g,分别在温度为50、60、70、80、90 ℃ 5个梯度下,研究提取温度对华南忍冬总酚酸含量的影响。

1.2.2.3 提取时间对华南忍冬总酚酸含量的影响 设定微波功率为400 W,乙醇浓度为80%,液料比12∶1 mL/g,温度70 ℃,分别在时间为10、20、30、40、50 min 5个时间段下,研究提取时间对华南忍冬总酚酸含量的影响。

1.2.2.4 微波功率对华南忍冬总酚酸含量的影响 设定温度70 ℃,提取时间30 min,80%乙醇,液料比12∶1 mL/g,分别在微波功率为100、200、300、400、500 W 5个梯度下,研究微波功率对华南忍冬总酚酸含量的影响。

1.2.2.5 液料比对华南忍冬总酚酸含量的影响 设定微波功率为400 W,提取时间30 min,温度70 ℃,乙醇浓度为80%,分别在液料比为8∶1、10∶1、12∶1、14∶1、16∶1 mL/g 5个梯度下,研究液料比对华南忍冬总酚酸含量的影响。

1.2.3 响应面优化试验 采用Box-Behnken的中心组合原理为依据,以提取温度(A)、微波功率(B)和液料比(C)为自变量,总酚酸的含量为因变量,采用3因素3水平响应面优化提取工艺,并建立数学回归模型，实验设计因素见表1。

表1 响应面试验因素水平设计Table 1 Factors and levels tabe of response surface experiment

1.2.4 微波提取法与其他提取方法的比较 本文将微波辅助提取法与传统的2种提取方法相比较,以总酚酸含量为考察指标,比较三种提取方法之间的差异。

1.2.4.1 乙醇回流法 取5.00 g华南忍冬,加100 mL 80%乙醇,在80 ℃加热回流3次,每次1 h,过滤并合并滤液,收集滤液至500 mL容量瓶中,加80%乙醇定容,备用[15]。

1.2.4.2 浸渍法 取5.00 g华南忍冬,加入300 mL 80%乙醇,浸渍12 h,过滤,收集滤液至500 mL容量瓶中,加80%乙醇定容,备用[20]。

1.2.5 华南忍冬总酚酸含量测定

1.2.5.1 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的绿原酸对照品5.2 mg,加适量无水乙醇溶解,定容于25 mL的容量瓶中,振荡均匀,并放置于冰箱保存备用(以每1 mL中含绿原酸0.2 mg)[20]。

1.2.5.2 标准曲线的绘制 取绿原酸对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL至25 mL棕色容量瓶中,加无水乙醇至5 mL,摇匀后加0.3%十二烷基硫酸钠溶液2 mL及0.6%三氯化铁-0.9%铁氰化钾(1∶0.9)混合溶液1 mL,混匀,暗处放置5 min,用0.1 mol/L盐酸定容至25 mL,以不加样品的显色剂为空白,在762 nm波长处测定吸光度(A)[21]。以绿原酸浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线得线性回归方程y=0.0749x+0.3023(R2=0.9991)。结果表明,绿原酸在0.83～4.16 μg/mL与吸光度呈良好线性关系。华南忍冬总酚酸含量计算以绿原酸计。

1.2.5.3 总酚酸含量的计算 每个实验重复3次,计算公式如下:

华南忍冬总酚酸含量(mg/g)=c×V×10-3/m

式中:c为提取液中华南忍冬总酚酸的浓度,μg/mL;V为华南忍冬总酚酸提取液体积,mL;m为华南忍冬质量,g。

1.2.6 华南忍冬总酚酸体外抗氧化试验

1.2.6.1 华南忍冬总酚酸对DPPH自由基清除率的测定 将华南忍冬提取物、对照品槲皮素和维生素C分别加无水乙醇配制成浓度为1.44、2.88、5.76、11.52、23.04 μg/mL的样品溶液。分别精密移取2 mL样品溶液于15 mL试管中,加入0.1 mmol/L的DPPH溶液2 mL,充分混匀,室温下避光反应30 min,于517 nm波长处测定其吸光度,记为Ai。同时测定不含样品的溶液作为空白对照Ac,平行测量3次[22]。以样品浓度为自变量,吸光度值为因变量作图并进行线性拟合,计算IC50值,其中IC50值定义为清除率为50%时所需抗氧化剂的浓度,所需浓度越低,表明该物质抗氧化性越强[23]。

DPPH自由基清除率(%)=(1-Ai/Ac)×100

1.2.6.2 铁离子还原能力的测定 采用普鲁士蓝还原法,参考代沙的研究方法做了调整[24]。取1.2 mL稀释后的华南忍冬提取液、对照品槲皮素和维生素C,加pH=6.6的磷酸缓冲液1.0 mL和1%铁氰化钾溶液1.0 mL,混合后在50 ℃放置20 min。然后反应液急速冷却,加入10%三氯乙酸2.5 mL混合,用蒸馏水定容到10 mL。将样品以3000 r/min速度离心10 min,取上清夜2.5 mL加入0.1%三氯化铁0.5 mL,混匀后用蒸馏水定容到5 mL,暗处放置10 min,在700 nm波长处测定吸光度A[25]。试剂空白为参比溶液。吸光度越高,抗氧化性越好,还原能力越强。以样品浓度为自变量,吸光度值为因变量作图并进行线性拟合,计算EC50值,其中EC50值定义为能引起50%最大效应的浓度,所需浓度越低,表明该物质抗氧化性越强[26]。

1.3 数据处理

运用Origin 8.0及Design Expert 8.0.6软件进行数据整理及分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 乙醇浓度对总酚酸含量的影响 图1可以看出,随着乙醇浓度的增加,总酚酸含量逐渐增加,说明目标成分更易溶解于乙醇溶液中,但乙醇浓度达到80%时,继续提高浓度,总酚酸含量下降,说明当乙醇浓度过高,出现一些脂溶性杂质,例如甾醇类或黄酮类化合物,从而使总酚酸的总酚酸含量下降[16]。由以上结果分析,在乙醇浓度为80%时,达到最大值,若继续增加乙醇浓度进行响应面考察,除了影响总酚酸含量,样品后处理也非常困难。因此,本实验选取80%乙醇提取总酚酸。

图1 乙醇浓度对华南忍冬总酚酸含量的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on total phenolic acid content of Lonicera confusa

2.1.2 提取温度对总酚酸含量的影响 由图2可看出,随着温度的升高,总酚酸含量逐渐增加,可能是分子热运动的原因加快了酚酸类化合物溶解到溶液中;温度到达70 ℃后,继续升高,总酚酸含量下降,这是由于温度过高,总酚酸中可能有一些成分结构不稳定而被破坏,含量降低[27]。因此,本实验选择在60～80 ℃的范围内通过响应面方法优化提取温度。

图2 提取温度对华南忍冬总酚酸含量的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on total phenolic acid content of Lonicera confusa

2.1.3 提取时间对总酚酸含量的影响 由图3可看出,随着提取时间的增加,总酚酸含量逐渐增加,可能是酚酸类化合物被溶剂从植物细胞中溶解到溶液中需要一定时间,随着时间的延长,总酚酸含量基本没有明显变化。因此,从结果看出在30 min时,总酚酸含量达到最大值,若继续增加提取时间进行响应面考察,总酚酸含量变化小,同时会增加大量能耗,故选择最佳提取时间为30 min。

图3 华南忍冬提取物、槲皮素(QUE)、维生素C(VC)的抗氧化活性比较Fig.3 Antioxidant effects of the extracts of Lonicera confuse flower,quercetin(QUE),and ascorbic acid(VC)注:A. DPPH自由基清除能力;B.铁离子还原能力。

图3 提取时间对华南忍冬总酚酸含量的影响Fig.3 Effect of extraction time on total phenolic acid content of Lonicera confusa

2.1.4 微波功率对总酚酸含量的影响 由图4可看出,随着微波功率逐渐增加,总酚酸含量逐渐增加,可能是高频电磁波穿透该植物细胞膜到达细胞内部,通过微波能使细胞内部的温度迅速上升,导致细胞破裂,其内的酚酸类化合物自由流出;但微波功率超过400 W后,总酚酸含量下降,经过反复试验,推断是当微波功率过高时,温度不易控制,同时反应体系温度开始上升,因而总酚酸含量下降[27]。因此,在响应面分析中,选择在300～500 W的范围内优化微波功率。

图4 微波功率对华南忍冬总酚酸含量的影响Fig.4 Effect of microwave power on total phenolic acid content of Lonicera confusa

2.1.5 液料比对总酚酸含量的影响 由图5可看出,当液料比在8∶1～12∶1 mL/g的范围内时,总酚酸含量逐渐增加;在液料比超过12∶1 mL/g,总酚酸含量下降。可能随着溶剂量的增加,大量杂质从华南忍冬中析出,例如黄酮类化合物,从而降低了总酚酸的含量[28]。因此,选择在10∶1～14∶1 mL/g的范围内进一步通过响应面分析。

图5 液料比对华南忍冬总酚酸含量的影响Fig.5 Effect of liquid-solid ratio on total phenolic acid content of Lonicera confusa

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面回归模型建立与分析 根据单因素实验优化的结果,以Box-Behnken的中心组合原理为依据,进一步详细考察提取温度(A)、微波功率(B)和液料比(C)相互之间对华南忍冬总酚酸含量的影响,利用统计学分析软件Design Expert 8.0.6软件建立数字回归模型,确定华南忍冬中总酚酸最佳提取工艺条件,结果见表2。得回归方程:

表2 响应面分析试验设计及结果Table 2 The analysis results of response surface experiment

Y(mg/g)=57.76-1.18A-0.77B+2.22C-2.81AB+0.61AC+0.12BC-13.92A2-14.49B2-18.30C2

表3 回归方程方差分析结果Table 3 Analysis results of regression and variance

模型中因素一次项C,交互项AB二次项A2、B2和C2对华南忍冬总酚酸含量有高度显著的影响(P<0.001),一次项A对华南忍冬总酚酸的含量有极显著影响(P<0.01),一次项B对华南忍冬总酚酸的含量有显著影响(P<0.05),各因素对华南忍冬中总酚酸含量的影响依次为:液料比(C)>提取温度(A)>微波功率(B)。

2.2.2 响应面交互作用分析 各因素交互作用对华南忍冬总酚酸含量影响的响应曲面如图6所示。据图6A所示为提取温度与微波功率的交互影响效应,由三维曲线图可看出,在提取温度较低时,总酚酸含量逐渐增加,之后趋于减少。由于酚酸类化合物含有酚羟基,可能在高温情况下发生氧化等反应,而使总酚酸含量减小。在300～400 W范围内,总酚酸含量随着温度升高而增加,当超过400 W后,含量逐渐减少。并且微波功率和提取时间的交互对响应值的影响显著(P<0.05)。

图6B显示了微波功率为零水平时液料比和提取温度之间的交互影响效应,液料比例较低时,总酚酸含量随液料比例增加呈现先上升后下降的趋势;提取温度较高时,总酚酸含量随温度升高呈下降趋势,温度越高,下降幅度越大。虽然液料比和提取温度对响应值而言都具有显著影响,但二者交互对响应值的影响不显著(P>0.05)。

图6C显示了提取温度为零水平,液料比与微波功率对总酚酸含量的影响和两者之间的交互作用。微波功率较低时,总酚酸含量随功率增大呈现先上升后下降的趋势;液料比例较高时,总酚酸含量随液料比增加呈下降趋势,液料比例越大,下降幅度越大。虽然液料比和提取功率对响应值而言都具有显著影响,但二者交互对响应值的影响不显著(P>0.05)。

图6 各因素交互作用的响应面图Fig.6 Response surface plot of interaction of various factors

2.3 最佳工艺验证

通过响应面软件中回归模型得出所考察的三个因素最佳条件为:微波功率398.20 W,提取温度69.35 ℃,液料比12.14∶1 mL/g,总酚酸含量预测值57.76 mg/g。经实际调整,确定总酚酸最佳提取工艺条件:乙醇浓度80%,微波功率400 W,提取温度70 ℃,提取时间为30 min,液料比12∶1 mL/g,以此条件进行3次重复性试验,测得华南忍冬总酚酸的含量为59.45±0.13 mg/g,RSD=0.94%,由此可说明模型和方法的可行性和有效性良好。

2.4 与传统提取方法相比

本研究将传统2种提取方法与微波辅助提取法以总酚酸含量为考察指标进行了对比。如表4所示,通过微波辅助提取法与2种提取方法的比较,发现该方法不仅增加了提取效率(总酚酸含量提高了近2倍),还显著地降低了提取时间(从12 h降低到0.5 h)。以上结果表明,微波辅助提取法具有巨大的潜力,有望成为一种从华南忍冬中快速、高效、绿色的提取总酚酸的方法。

表4 不同提取方法提取效果的影响(n=3)Table 4 Effect of different extraction methods on the extraction yield of total phenolic acids(n=3)

2.5 体外抗氧化活性

2.5.1 对DPPH自由基的清除能力 不同浓度的华南忍冬提取物(总酚酸含量为60.23 mg/g)、槲皮素、维生素C对DPPH自由基清除能力如图7A所示。3种物质在实验浓度范围内对DPPH自由基的清除能力呈现一定的量效关系,即随着浓度的增加,清除率也随之增加,并且3种物质在相同浓度下抑制自由基的能力有所差异。在实验浓度范围内,华南忍冬提取物、槲皮素、维生素C的IC50分别为21.26、8.08、13.19 μg/mL。因此,抗氧化活性大小顺序为:槲皮素>维生素C>华南忍冬提取物。通过与文献中桑叶酚酸提取物(IC50=4690 μg/mL)和棕笋酚酸提取物(IC50=690 μg/mL)相比较[30-31],发现华南忍冬提取物具有较好的清除自由基的能力。

2.5.2 铁离子还原能力 华南忍冬提取物(总酚酸含量为60.23 mg/g)、槲皮素、维生素C的还原能力测试结果如图7B所示,3种物质均有不同程度的还原能力,槲皮素、华南忍冬提取物、维生素C的EC50值分别为28.74、39.37、36.28 μg/mL。EC50值越低,表明该物质还原能力越强。其还原能力强弱顺序为:槲皮素>维生素C>华南忍冬提取物。并与文献[32-33]中其它植物的酚酸提取物相比较,铁离子还原能力分别是鼠尾草提取物的10倍和木贼提取物的3倍,说明该提取物具有较好的还原能力。

抗氧化实验结果表明,华南忍冬提取物具有潜在的抗氧化活性,原因可能是华南忍冬含有丰富的酚酸类化合物。

3 结论

本课题通过微波提取法对华南忍冬总酚酸的提取工艺进行了研究,分别评价了乙醇浓度、液料比、提取温度、提取时间及微波功率 5个因素对华南忍冬总酚酸提取率的影响。在单因素实验基础上,利用响应面分析法优化了华南忍冬总酚酸提取工艺,最佳的工艺条件为乙醇浓度为80%、液料比为12∶1 mL/g、提取温度为70 ℃、提取时间为30 min、微波功率为400 W。在此条件下,华南忍冬总酚酸的提取率达到最大值为59.45 mg/g,与模型预测值57.76 mg/g相近。同时研究了华南忍冬总酚酸对DPPH自由基的清除能力和铁离子还原能力的影响。结果表明,华南忍冬总酚酸的DPPH自由基清除 IC50为21.26 μg/mL,而铁离子还原能力的EC50为39.37 μg/mL,华南忍冬总酚酸具有一定的抗氧化能力。以上研究为华南忍冬药材的综合开发利用提供依据。