超声法提取海南眼树莲总三萜的工艺优化及其抗氧化性

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(1.海南医学院第一附属医院药学部,海南海口 570102;2.海南医学院药学院,海南海口 571199)

眼树莲(Dischidiachinensis),别名上树瓜子、翼鱼草等,为萝藦科眼树莲属附生藤本植物,生长在低至中海拔的山地林谷或旷地,在我国其主产于海南、广东和广西[1]。民间将眼树莲全草入药,用于清肺化痰、凉血解毒、治疗眼睛疾病等[2-3]。霍丽妮等[4]研究了眼树莲全株中总酚和总黄酮的体外抗氧化活性,发现眼树莲乙酸乙酯部位具有较强抗氧化性。杨柳等[5-7]对海南产眼树莲不同提取物进行了抗炎和抗肿瘤活性研究,发现眼树莲具有抗炎和抗肿瘤活性。余邦良等[8]对眼树莲乙酸乙酯萃取部位进行分离提纯,首次从眼树莲中分离得到10个单体化合物,大部分为萜类化合物。综上说明眼树莲的活性成分为萜类化合物。萜类化合物是中草药中一类比较重要的化合物,且已经发现很多萜类化合物是中草药的有效成分[9]。萜类化合物除了具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、抗疟、抗心血管疾病、降血糖等活性外,还具有其他生物学和药理学活性,如抗虫、免疫调节、抗氧化、抗衰老、神经保护等[10]。

目前,植物三萜化合物提取,主要采用传统溶剂浸提、索氏提取、溶剂回流提取法、超声提取等方法[11]。而超声波提取具有设备简单、提取效率高、时间短、操作方便、节能等优点[12],本研究选取超声波提取作为眼树莲总三萜的提取方法。现已有一些关于三萜类化合物提取工艺的研究,李志等[13]利用乙醇超声波浓缩方法提取薏苡仁中三萜类化合物,陆春菊等[14]采用乙醇超声提取大飞扬草中三萜化合物。这些研究均以乙醇作为提取溶剂，目的是提高眼树莲中总三萜的提取量。目前未见眼树莲中总三萜提取工艺及其抗氧化活性的报道。本文通过单因素和正交优化试验考察了溶剂种类、超声时间、料液比、超声功率、提取温度等因素对提取量的影响,并对总三萜抗氧化活性进行研究,期待建立一种有效、快捷、简单的方法来获取更多的眼树莲中的总三萜,为眼树莲进一步在保健食品及生物医药等领域的进一步开发利用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜眼树莲 于2018年9月采自海南省海口市秀英区,海南大学刘寿柏副教授鉴定为萝藦科植物眼树莲(Dischidiachinensis),编号为YSL-201809;齐墩果酸 HPLC≥98%,上海源叶生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) HPLC≥98.5%,上海麦克林生化科技有限公司;L-抗坏血酸(VC) 分析纯,上海麦克林生化科技有限公司;乙酸乙酯、香草醛、高氯酸、冰醋酸 均为分析纯,广东西陇化工试剂有限公司。

722N可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司;SK3210HP超声波清洗器 上海科导超声仪器有限公司;AE100电子分析天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;HC-2518台式高速离心机 科大创新股份有限公司;HH-60电热恒温水浴箱 常州国华电器有限公司;DFT-200C药用粉碎机 温岭市林大机械有限公司;RE-2000B型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;DHG-9075A型电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 眼树莲总三萜的提取工艺 采集新鲜的海南本地眼树莲,切成小块,晒干,粉碎,过40目筛,得眼树莲粉末2 kg。每次准确称取眼树莲粉末2.00 g,置于三角瓶中,加入溶剂搅拌均匀,在一定的超声提取时间、料液比、超声功率和温度条件下进行总三萜的分离,超声完成后,抽滤得到提取液,备用[15]。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 不同溶剂对眼树莲总三萜提取量的影响 精确称取2.00 g眼树莲粉3份分成3个实验组,分别在不同溶剂乙醇、石油醚、乙酸乙酯,料液比均为1∶30 (g/mL),超声功率均为150 W,提取温度均为50 ℃,提取时间均为40 min条件下,根据1.2.1项方法获取眼树莲总三萜提取液,考察不同溶剂提取眼树莲总三萜的提取量情况[16]。

1.2.2.2 不同超声提取时间对眼树莲总三萜提取量的影响 精确称取2.00 g眼树莲粉末5份分成5个实验组,分别在超声浸提时间为20、30、40、50和60 min,均以1.2.2.1项试验确定的溶剂,固定其他条件下,根据1.2.1项方法获取眼树莲总三萜提取液,考察不同超声提取时间对眼树莲总三萜的提取量情况[17]。

1.2.2.3 不同料液比对眼树莲总三萜提取量的影响 精确称取2.00 g眼树莲粉末5份分成5个实验组,分别在料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 (g/mL)下浸提,均以1.2.2.1项确定的溶剂,以1.2.2.2项确定的超声时间,固定其他条件下,根据1.2.1项方法获取眼树莲总三萜提取液,考察不同料液比对眼树莲总三萜的提取量情况。

1.2.2.4 不同超声功率对眼树莲总三萜提取量的影响 精确称取2.00 g眼树莲粉末5份分成5个实验组,分别在超声功率为100、150、200、250和300 W下提取,以1.2.2.1项确定的溶剂,以1.2.2.2项确定的超声时间,以1.2.2.3项确定的料液比,固定其他条件下,根据1.2.1项方法获取眼树莲总三萜提取液,考察不同超声功率对眼树莲总三萜的提取量情况。

1.2.2.5 不同温度对眼树莲总三萜提取量的影响 精确称取2.00 g眼树莲粉末5份分成5个实验组,分别在温度为40、45、50、55和60 ℃下,均以1.2.2.1项确定的溶剂,均以1.2.2.2项确定的超声时间,以1.2.2.3项确定的料液比,均以1.2.2.4项确定的超声功率的条件下,根据1.2.1项方法获取眼树莲总三萜提取液,考察不同温度对眼树莲总三萜的提取量情况[18]。

1.2.3 正交试验 以单因素实验为基础,考察超声提取时间、料液比、超声功率、温度,采用正交试验L9(34),正交试验因素水平见表1,平行测定3次,求眼树莲中总三萜平均提取量,以总三萜提取量为评价指标,确定最佳提取工艺。

表1 眼树莲中总三萜提取工艺正交试验因素水平表Table 1 Orthogonal test factor level table for extractiontechnology of total triterpenoids from Dischidia chinensis

1.2.4 总三萜含量测定

1.2.4.1 测定波长的选择 精确称取齐墩果酸12.00 mg,无水乙醇为溶剂,定容于25 mL容量瓶中,配制成齐墩果酸标准溶液0.48 mg/mL。精密量取0.20 mL齐墩果酸标准溶液,置于10 mL比色管中,80 ℃水浴加热至目测有机溶剂挥发完为止,加5%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL,高氯酸0.7 mL,摇匀。在70 ℃的恒温水浴中加热15 min,取出用冰浴迅速冷却至常温,加入4 mL乙酸乙酯摇匀。以空白溶剂为参比,在400～800 nm范围扫描其吸收光谱,确定眼树莲总三萜的测定波长[13,16]。

1.2.4.2 标准曲线的制作 根据1.2.4.1项中方法制备齐墩果酸储备溶液0.48 mg/mL,用储备溶液分别配制4、6、8、10、12、16 μg/mL的系列标准溶液。在吸收光谱的最大波长测定吸光度,以齐墩果酸系列标准溶液浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线,得到线性方程及相关系数。

1.2.4.3 总三萜提取量的计算 将1.2.1项中眼树莲总三萜提取液成倍稀释后,取稀释后溶液1 mL,在1.2.4.1项中确定的波长和方法下测定其吸光度值范围为0.2～0.8,记录其吸光度值,根据以下公式,计算眼树莲总三萜的提取量[13,15]。

总三萜提取量(mg/g)=m×c×10-3/M

式中:m:测得的吸光度在齐墩果酸标准线上显示的齐墩果酸含量(mg);c:稀释倍数;M:样品质量(g)。

1.2.5 眼树莲中总三萜清除DPPH·能力测定 利用正交试验优化的最佳工艺提取眼树莲总三萜,将其获得的总三萜提取液在45～50 ℃旋蒸浓缩至浸膏,冷冻干燥得眼树莲总三萜粗品。精密称取眼树莲总三萜粗品和VC(抗坏血酸),分别用无水乙醇配成0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、1.00、2.00 mg/mL系列浓度的总三萜溶液和VC溶液,备用。精密称取20.00 mg DPPH,用无水乙醇溶解并定容为250 mL,配制成浓度为2×10-4mol/L DPPH标准溶液。量取pH6.86混合磷酸盐缓冲液、2×10-4mol/L DPPH溶液各4 mL,加入10 mL比色管中,摇匀,分别加入不同浓度的待测总三萜溶液或VC溶液1 mL,加水至10 mL,混匀,避光,密闭反应30 min后,以未加待测溶液的溶剂为空白对照,用无水乙醇作为参比溶液,于520 nm处测定吸光度,计算清除率。每个浓度的总三萜溶液和VC溶液均测定3次,将各溶液浓度与DPPH·清除率拟合线性,观察其线性关系,计算半数清除率IC50值[19-23]。

计算清除率公式[20]:

DPPH·清除率(%)=[(A0-A1)/A0]×100

式中:A0为DPPH溶液本身的OD值(空白对照),A1为加入总三萜溶液或者VC溶液的DPPH溶液的OD值。

1.2.6 超声提取法与其他提取法的比较 精确称取眼树莲粉末2.00 g,固定提取时间为30 min,料液比1∶20 (g/mL),提取温度55 ℃(传统溶剂浸提除外),分别采用超声提取法、传统溶剂浸提法、索氏提取法比较3种方法提取眼树莲中总三萜的提取量[24]。具体实验参数见表2。

表2 3种提取方法实验具体实验参数Table 2 Experimental parameters ofthree kinds of extraction methods

1.3 数据处理

每组实验处理设置3次重复。使用软件Microsoft Excel 2016和SPSS 19.0进行数据分析与统计。

2 结果与分析

2.1 测定波长的选择

齐墩果酸的最大吸收曲线见图1,齐敦果酸标准溶液的最大吸收波长为560 nm,故选择560 nm作为总三萜测定的波长。

图1 齐墩果酸吸收光谱图Fig.1 Absorption spectrogram of oleanolic acid

2.2 标准曲线的绘制

齐敦果酸的标准曲线见图2,其线性回归方程为y=0.0238x+0.05,R2=0.9999,线性关系良好。

图2 齐敦果酸标准曲线Fig.2 Standard curve of oleanolic acid

2.3 单因素实验结果

2.3.1 不同溶剂对眼树莲中总三萜提取量的影响 不同溶剂对眼树莲中总三萜提取量的影响实验结果见图3,乙醇的提取量为10.54 mg/g,石油醚的提取量为7.31 mg/g,乙酸乙酯的提取量为14.92 mg/g,其中乙酸乙酯作为溶剂提取眼树莲中总三萜提取量最高,故选取乙酸乙酯作为提取溶剂。

图3 不同溶剂对眼树莲中总三萜提取量的影响Fig.3 Effect of different solvents on the yield oftotal triterpenoids from Dischidia chinensis

2.3.2 超声时间对眼树莲中总三萜提取量的影响 超声时间对眼树莲中总三萜提取量的影响结果见图4。由图4可知,眼树莲中总三萜的提取量随提取时间呈先升高后降低的趋势。浸提时间在20～40 min之间总三萜的提取量不断上升,在40 min时眼树莲总三萜的提取量达到最大,为17.44 mg/g,随后总三萜的提取量逐渐降低。造成此现象的原因可能是刚开始时物料与溶剂的接触越来越充分,故提取量有所增加,而后随时间的增加溶出的杂质增多,从而阻碍了浸提效果[13,25]。由于超声时间为50、60 min时，总三萜含量明显降低，故眼树莲中总三萜适宜的超声时间为20～40 min。

图4 超声时间对眼树莲中总三萜提取量的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on the yield oftotal triterpenoids from Dischidia chinensis

2.3.3 料液比对眼树莲中总三萜提取量的影响 不同料液比对眼树莲中总三萜提取量的实验结果见图5,由图5可知,料液比小于1∶30 (g/mL)时,眼树莲中总三萜提取量随料液比的增加而增加,料液比较低时料液粘稠,不利于超声波空化作用,也阻碍了超声波在溶剂中的传播扩散[15],故随着料液比的增加,眼树莲中总三萜提取量提高。当料液比超过1∶30 (g/mL)之后提取量随料液比增加而呈下降趋势,可能因溶剂量过多反而影响了超声波对眼树莲细胞的破碎,进而影响了机械学和热力学作用[15],从而导致眼树莲中总三萜提取量下降。另外从经济角度考虑,料液比过大也会增加溶剂和能耗从而造成浪费,并增加下一步浓缩工序的难度[13,26],故选择适宜的提取料液比为1∶10～1∶30 (g/mL)。

图5 料液比对眼树莲中总三萜提取量的影响Fig.5 Effect of material liquid ratio on the yield oftotal triterpenoids from Dischidia chinensis

2.3.4 超声功率对眼树莲中总三萜提取量的影响 超声功率对眼树莲中三萜化合物提取量的影响实验结果见图6,由图6可知,随超声功率的增加,眼树莲中总三萜的提取量呈先上升后下降的趋势。当超声波功率达到200 W时,总三萜的提取量到达最大值,此时是由于超声波的空化作用与机械作用达到最佳结合点,眼树莲中总三萜完全溶出所致[13]。一般认为,超声功率越大,产生的机械效应和空化效应越强烈[18]。所以,在一定超声功率内,眼树莲中总三萜的扩散速度随功率的增加也增快,进而总三萜的提取量也随之升高。但是当超声波功率达到一定值后,超声介质的内外渗透压基本相等,再提高超声功率有效成分的渗出作用不明显[13],这时眼树莲的表面可能形成一道屏障,影响总三萜浸提,所以这时超声波功率越大反而提取量越小。故超声功率选择150～250 W为宜。

图6 超声功率对眼树莲中总三萜提取量的影响Fig.6 Effect of ultrasonic power on the yield oftotal triterpenoids from Dischidia chinensis

2.3.5 温度对眼树莲中总三萜提取量的影响 不同温度对眼树莲中总三萜提取量的影响实验结果见图7,图7可知,随着超声温度的升高,总三萜提取量逐渐增加,当温度大于55 ℃以后提取提取量开始下降,这是由于随着温度的上升,物质扩散速率增加,分子运动越剧烈,有利于三萜化合物的提取[27]。但是温度过高,会影响三萜化合物结构的稳定,一些热敏性的三萜化合物逐渐分解,继而导致提取量下降,故选择适宜的提取温度为45～55℃。

图7 温度对眼树莲中总三萜提取量的影响Fig.7 Effect of temperature on the yield oftotal triterpenoids from Dischidia chinensis

2.4 正交试验结果

从正交优化试验结果表3可知,经过均值和极差分析与比较,极差值R越大,说明该因素对总三萜提取量的影响越大[28],各因素对眼树莲中总三萜提取量影响作用的主次关系为B>D>C>A,即料液比>温度>超声功率>超声时间。由表4正交试验方差分析结果可知,料液比、温度对眼树莲中总三萜提取量有较大影响,并具有显著性差异(P<0.05),超声提取时间、超声功率对眼树莲中总三萜提取量的影响较小,无显著差异(P>0.05)。由k值大小可知,正交试验优化得出的工艺组合为A2B2C2D1,而正交试验中提取提取量最高的组合为A1B3C2D1,因料液比对眼树莲中总三萜提取量影响最大,将两个组合进行验证实验,实验结果见表5。

表3 眼树莲中总三萜提取工艺正交试验结果Table 3 Orthogonal experiment results of extractiontechnology of total triterpenoids from Dischidia chinensis

由表5验证实验结果可知,眼树莲提取总三萜提取量的最优提取工艺为A2B2C2D1,即超声提取时间30 min,料液比1∶20 (g/mL),超声功率200 W,超声温度55 ℃,平行提取3次,获得眼树莲中总三萜的最高提取量为20.82 mg/g,RSD为0.16%。

表4 眼树莲中总三萜提取工艺方差分析结果Table 4 Analysis of variance of extraction technology oftotal triterpenoids from Dischidia chinensis

表5 验证实验结果(n=3)Table 5 Results of verification experiment(n=3)

2.5 眼树莲中总三萜清除DPPH·测定结果

实验结果见图8,由图8可知,在浓度0.05～2.00 mg/mL范围内,眼树莲总三萜对DPPH·清除能力随总三萜的浓度增大而升高,当浓度达到1.00 mg/mL后,其清除率达到26.08%,之后当浓度增加至2.00 mg/mL,清除率为26.86%,增加不很明显,并接近于平衡,其线性方程为y=10.557x+9.201,R2=0.8349。在同样实验条件下,VC对DPPH·清除率随着浓度的变大迅速提高,当VC浓度达到2.00 mg/mL,清除为91.79%,曲线趋于直线,其线性方程为y=32.7x+29.321,R2=0.9748。根据SPSS软件数据分析,眼树莲总三萜的IC50为3.218 mg/mL,对照品VC的IC50为0.582 mg/mL。实验结果表明,眼树莲总三萜对具有一定DPPH·清除能力,但是与VC相比较,DPPH·消除能力较弱,说明其抗氧化能力不是很强。

图8 眼树莲中总三萜和VC对DPPH·的清除作用Fig.8 Total triterpenoids from Dischidia chinensisand ascorbic acid on DPPH· radical

2.6 超声提取法与其他提取法比较的实验结果

3种提取方法提取比较实验结果见表6,由表6可知,超声提取的提取量明显高于其他两种方法。

表6 3种提取方法实验结果的比较Table 6 Comparison of experimental resultsof three extraction methods

3 结论

在单因素实验的基础上,通过正交试验设计,比较深入地研究了超声提取时间、料液比、超声功率和提取温度等因素对眼树莲提取总三萜提取量的影响,确定了各因素参数。实验结果表明,各因素对眼树莲中总三萜提取量影响作用的顺序为:料液比>温度>超声功率>超声时间。料液比、温度对眼树莲中总三萜提取量有较大影响,并具有显著性差异(P<0.05),超声提取时间、超声功率对眼树莲中总三萜提取量的影响较小,无显著差异(P>0.05)。最佳提取工艺为:超声提取时间为30 min,料液比为1∶20 (g/mL),超声波功率为200 W,温度为55 ℃。在该条件下,眼树莲总三萜的平均提取量是20.82 mg/g。该工艺提取获得的眼树莲总三萜浓度为2.00 mg/mL时,对DPPH·的清除率为26.86%。将该实验方法与传统溶剂浸提、索氏提取进行比较,其提取量明显高于其他两种方法,综合多方面考虑,采用超声波辅助法对眼树莲中总三萜的提取率较高,同时该方法具有设备简单、提取效率高、时间少、操作简便、节约能源等优点[13],是提取眼树莲中总三萜的一种有效方法。