抗霾清肺饮的制备工艺及其功效研究

周文静1,刘必旺1,张 萌1,王珊珊1,秦 楠

(1.山西中医药大学基础医学院,山西晋中 030619;2.山西中医药大学制药与食品工程学院,山西晋中 030619)

“雾霾”是指空气中存在的有毒有害颗粒物与水汽的混合物,是霾与雾的结混合物,称为雾霾。近年来,中国不少地区都出现了“雾霾天气”,甚至作为一种灾害性天气出现,因雾霾可引起呼吸、心血管、生殖系统等多方面疾病[1],人们“谈霾色变”。雾霾的元凶PM2.5具有直径小、毒性强的特点,可随呼吸进入支气管、细支气管,最后沉降于肺泡[2],由于缺乏清除措施,可形成慢性肺组织损伤[3]。对雾霾引发的健康问题不仅需要药物治疗,更需要提前预防,研究一种有效的抗霾清肺功能食品具有重要意义。

中医强调“正气存内,邪不可干”[4],黄芪为常用补气药,始载于《神农本草经》,列为上品,味甘,微温,归肺、脾经,具有益气固表、托毒敛疮、利水消肿等作用[5]。现代药理研究表明,黄芪具有增强免疫的功能[6],可以治疗多种肺系疾病,如肺炎、肺纤维化、肺癌等[7-9]。同时黄芪作为2018年国家卫计委新增的药食同源药材,具有良好的开发前景。罗汉果(Siraitiagrosvenorii)为葫芦科多年生藤本植物的果实[10],是清咽利肺、止咳化痰的首选,其甜度较高,且不产生热量,安全无毒,是饮料、糖果行业上好的原料[11]。梨,百果之宗,具有生津止喝,止咳化痰,清肺去燥的功效,中医认为燥邪易伤肺,秋燥多食梨。

目前,抗雾霾的功能健康食品包括饮料、保健酒、茶等,其中保健饮料类最受国内研究者关注[12],但以黄芪为原料的抗霾清肺饮品,未见报道。本研究以黄芪、罗汉果、梨为原料,其中黄芪甲苷是黄芪中最主要的有效成分,一般含有黄芪的处方或者中成药都将其作为含量控制指标。黄芪甲苷属于黄芪多糖的一种,其具有较强的生物活性。研究报道,黄芪甲苷能有效改善PM2.5诱导大鼠的生存状态,减轻肺水肿和肺组织Mc Guigan病理评分,从而实现预防PM2.5所致急性肺损伤的目的[13]。本研究通过高效液相色谱(HPLC)法检测抗霾清肺饮中黄芪甲苷含量,采用单因素实验结合正交试验法优化抗霾清肺饮的制备工艺,并进一步通过动物实验考察其抗霾清肺作用,以期为抗霾清肺饮料开发研制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄芪(膜荚黄芪)、罗汉果(拉江果) 山西维康堂中药饮片有限公司;黄原胶 河北万邦实业有限公司;白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒 南京建成生物有限公司;皇冠梨、香烟(红塔山)、蒸馏水 市售;甲醇 天津四友精细化学品有限公司;黄芪甲苷对照品(批号:105753-20 1809) 上海禾午生物科技有限公司;小鼠(SPF级,BALB/C,生产和使用许可证号:SCXK(京)2016-0011) 北京维通利华实验动物技术有限公司。

Waters2695型高效液相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司;BS224S1/万电子天平 德国赛多利斯集团;霾表M1 汉王科技股份有限公司;DL-5-B低速离心机 上海安亭科学仪器厂;ZX-S24型全不锈钢恒温水浴锅 上海知信实验仪器技术有限公司;II-B(500 mL)型磁力搅拌电热套 天津市泰斯特仪器有限公司;RSCG01-1型超高温瞬时灭菌机 郑州玉翔机械设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 抗霾清肺饮的制备工艺 工艺流程:黄芪、罗汉果、梨→浸泡→煎煮过滤→复煎→离心→调配→均质→罐装灭菌→冷却→成品

工艺要点:a煎煮与离心:选取一定量黄芪、罗汉果的干燥饮片,将罗汉果敲碎成小块,加水浸泡30 min。然后加入切成1 cm小方块的梨,文火煎煮30 min,用两层纱布过滤得药液,静置。往滤渣中加入水,再次煮沸,文火煎煮20 min,用两层纱布过滤,合并煎煮液,浓缩。以3500 r/min的速度离心30 min,弃沉淀,然后进行抽滤,得滤液[14]。b调配与均质:滤液中直接添加一定量的黄原胶在75 ℃下水浴加热30 min,并用玻璃棒充分搅拌,使黄原胶充分溶解。将配制的饮料于均质机中,在20 MPa压力下均质处理,使溶液中成分物质均匀分布。c杀菌与灌装:在高温下瞬时灭菌,灭菌温度为120 ℃,时间为5 s。最后无菌的环境下灌装,封口,灌装的温度控制在恒温75 ℃左右,灌装之后冷却到室温[15-16]。

1.2.2 HPLC法测定黄芪甲苷含量

1.2.2.1 色谱条件 PersilBDSC18(200 mm×4.6 mm,5 μm)为色谱柱;流动相:乙腈-水(35∶65);流速:1.0 mL/min;检测波长260 nm;柱温35 ℃,进样量为10 μL,理论板数以黄芪甲苷峰计算应不低于8000。

1.2.2.2 溶液制备 对照品溶液的制备:精密称取黄芪甲苷5 mg,加入甲醇,配制成浓度为200 μg/mL的对照品溶液。

供试品溶液的制备:取抗霾清肺饮100 mL置分液漏斗中,加正丁醇溶液提取3次,每次100 mL,用氨试液洗涤3次,每次100 mL,弃去氨试液,取正丁醇层放入水浴锅中蒸干,最后残渣加甲醇溶解并定容到10 mL量瓶中,用微孔滤膜过滤,即得供试品溶液。

阴性对照液溶液的制备:根据抗霾清肺饮制备工艺,剔除黄芪,按供试品的制备方法制成阴性对照品溶液。

1.2.2.3 专属性考察 取黄芪甲苷对照品溶液、供试品溶液和缺黄芪的阴性对照品溶液,分别按“1.2.2.1”中色谱条件进样测定,记录色谱图。

1.2.2.4 标准曲线绘制 将冷藏保存的对照品溶液精密量取,体积为5 mL,加甲醇进行等梯度稀释,稀释后黄芪甲苷的浓度分别为:10、50、100、150、200 μg/mL。上机测量5种浓度的对照品溶液,绘制标准曲线。

1.2.2.5 样品测定 分别选取不同试验组别的抗霾清肺饮样品,按照“1.2.2.1”中色谱条件进样测定,以计算饮料中黄芪甲苷的含量。

1.2.3 单因素实验 按照各因素加入水的质量体积比进行试验。固定反应条件为罗汉果3%、梨30%、黄原胶0.15%,考察黄芪添加量(1%、5%、10%、20%、30%)对黄芪甲苷含量和感官评价的影响;固定反应条件为黄芪10%、梨30%、黄原胶0.15%,考察罗汉果添加量(1%、2%、3%、4%、5%)对黄芪甲苷含量和感官评价的影响;固定反应条件为黄芪10%、罗汉果3%、黄原胶0.15%,考察梨添加量(20%、30%、40%、50%、60%)对黄芪甲苷含量和感官评价的影响;固定反应条件为黄芪10%、罗汉果3%、梨30%,考察黄原胶添加量(0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%)对黄芪甲苷含量和感官评价的影响,从而确定各因素的最佳添加量。

表1 感官评分测试评价Table 1 Sensory score test evaluation

1.2.4 感官评定标准 本测试由20名有评定经验的专家组成评审组,以外观、香气、色泽、口感、组织状态五个方面为指标进行评定。取三次重复实验的平均值作为试验最终记录值。具体评分标准见表1。

1.2.5 正交试验 根据单因素实验结果确定黄芪、罗汉果、梨、黄原胶的因素水平。根据饮料中黄芪甲苷含量和对饮料感官品质的影响,采用 L9(34)正交表进行正交试验。正交试验因素水平表见表2。

表2 抗霾清肺饮正交实验因素和水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experimentfor anti-haze Qingfei drink

1.2.6 抗霾清肺饮功效测定

1.2.6.1 造模及给药 SPF级昆明小鼠40只,雌雄各半,体重18～20 g,随机分为空白组,模型组,抗霾清肺饮预防组,抗霾清肺饮治疗组,每组10只。适应饲养一周,预防组提前给药1周,灌胃按照1.5 mL/10 g抗霾清肺饮,每天2次,连续7 d。除空白组外,其余各组采用连续香烟烟雾暴露法建立雾霾小鼠模型,将小鼠置于塑料鼠笼中,盖好盖子,将3支香烟置于盖子上,将另一鼠笼倒扣于盖子上,制成半密闭空间,让烟自然燃烧,15 min后打开熏烟顶盖,待烟雾全部散去,小鼠休息5 min,然后再次点燃3支香烟重复上述步骤,每天熏烟2次,每次2 h,并用霾表实时监测,保证PM2.5浓度超标,通过检测小鼠病理切片,保证造模成功[17-18]。从第8 d开始治疗组灌胃抗霾清肺饮,每日2次,连续7 d,其余各组灌予相应剂量生理盐水。

1.2.6.2 肺组织病理检测 于末次给药后禁食12 h,将老鼠处死,取同一部位肺组织,放入10%甲醛溶液中固定,制备切片,HE染色,光镜观察。

1.2.6.3 TNF-α、IL-6含量测定 用0.25 mol/L蔗糖溶液制备肺组织匀浆,离心取上清液[19],按ELISA试剂盒说明书操作步骤进行测定TNF-α、IL-6含量。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 HPLC法测定黄芪甲苷含量

2.1.1 专属性考察结果 图1结果显示抗霾清肺饮供试品溶液色谱图呈现与黄芪甲苷对照品溶液相同保留时间的色谱峰,且基线平稳、分离度好,而阴性对照品溶液在此保留时间无色谱峰。

图1 黄芪甲苷高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of astragaloside IV

2.1.2 线性关系考察结果 以黄芪甲苷浓度为横坐标(Y),峰面积值为纵坐标(X),绘制标准曲线,可得回归方程为:Y=31.912X+462.46(r=0.9998)。结果显示黄芪甲苷在10～200 μg/mL的浓度范围内,线性关系良好。

2.2 单因素实验结果

以黄芪甲苷含量和感官评分为考察指标,确定各因素的最佳添加量。图2A显示,在其它因素固定的情况下,黄芪添加10%与20%时,黄芪甲苷含量最高为0.83 mg/mL。结合感官评分,当黄芪添加10%时,感官评分最高。可能由于药材本身具有浓烈的豆腥味,随着添加量增加,掩盖了其他原料的味道,药味太浓。而用量较少时,饮料香味偏淡,味道不突出。确定以黄芪添加量10%进行进一步实验。

图2B显示,当罗汉果添加量为1%与2%时黄芪甲苷含量最高,但随着罗汉果添加量增加,黄芪甲苷含量降低,可能由于配伍作用后影响黄芪甲苷含量。罗汉果添加量2%时感官评分最高,随着用量加大,罗汉果甜味过浓,感官评分值也降低。综合评定,确定罗汉果添加量为2%。

图2 不同因素对饮料黄芪甲苷含量和感官评分的影响Fig.2 Effects of different factors on astragaloside IV contents and sensory score of drink

图2C显示,梨的添加量为30%、40%、50%时,黄芪甲苷含量均为0.82 mg/mL,可以发现不同添加量的梨对黄芪甲苷含量影响不明显。梨味道香甜,添加量50%时,饮料有淡淡果味香气,感官评分最高,确定梨的添加量为50%。

图2D显示,黄原胶添加量为0.1%时,黄芪甲苷含量最高,且口味较协调,感官评分亦最高,当黄原胶添加较多时,饮料不清亮,给人不愉快感。确定黄原胶添加量为0.1%。

2.3 正交试验结果

抗霾清肺饮的主要成分为黄芪,其中黄芪甲苷是防治PM2.5,发挥抗霾清肺作用的主要有效成分[13],而感官评分是描述和判断产品质量最直观的指标,直接影响产品的质量与安全控制,因此设定黄芪甲苷的权重为0.5,感官评分的权重为0.5。根据公式(综合评分=[(黄芪甲苷含量/黄芪甲苷含量最大值)×0.5+(感官评分/感官评分最大值)×0.5]×100)计算,再以综合评分结果进行正交试验结果分析。表3可知,最佳工艺参数为A1B2C2D2。影响因素依次为A>C>D>B,可见黄芪添加量是最主要因素,影响最为突出,梨添加量次之,黄原胶添加量对品质的影响仅次于梨,罗汉果添加量对饮料影响最小。由此可得加入9%黄芪、2%罗汉果、50%梨、0.1%黄原胶口感最佳,为最优配比。

表3 正交实验结果Table 3 Orthogonal test results

2.4 验证试验

为了确保该制备工艺的可行性与合理性,按照优选的试验方案,进行了3次验证试验。结果见表4,三批抗霾清肺饮的黄芪甲苷含量为0.83～0.85 mg/mL,均值为0.84 mg/mL,黄芪甲苷含量与文献报道含黄芪的口服液中含量相近[20-21]。且感官评分均分为94.67分,接近于正交试验中最大值,表明抗霾清肺饮制备工艺稳定。

表4 验证试验结果(n=3)Table 4 Results of verification test(n=3)

2.5 抗霾清肺饮功能试验

2.5.1 HE染色结果 空白组肺组织形态正常,结构清楚,未见明显病变;模型组肺组织表现间质淋巴细胞浸润,瘀血,间质增厚,吞噬细胞增多,肺泡扩张,细支气管粘膜可见轻度增生;预防组与治疗组较模型组均有所减轻,未见粘膜炎症反应及分泌物,见图3。

图3 各组小鼠肺脏病理组织切片(HE,200×)Fig.3 Lung pathological sections ofmice in each group(HE,200×)

2.5.2 TNF-α、IL-6检测结果 TNF-α为炎症反应启动因子,可调节细胞炎症因子IL-6的释放,进而诱导炎症发生,引起肺组织损伤[22-24]。实验结果显示,与空白组相比,模型组TNF-α、IL-6含量极显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,治疗组TNF-α、IL-6含量极显著降低,差异有统计学意义(P<0.01),预防组TNF-α含量极显著降低,差异有统计学意义(P<0.01),见表5。说明抗霾清肺饮可以降低雾霾小鼠肺脏的炎性反应,通过抗炎而发挥作用。

表5 各组小鼠肺组织TNF-α、IL-6含量比较Table 5 Comparison of contents of TNF-αand IL-6 in lung tissues of mice in each group

3 结论

本研究采用中药传统汤剂的煎煮方法,遵循传统剂型,通过单因素实验与正交试验确定黄芪液添加量9%,罗汉果添加量2%,梨添加量50%,黄原胶添加量0.1%;在此配方下该产品呈黄棕色,均匀透亮,梨的果香与药香味相结合,酸甜适中,口感适宜。功能实验表明,抗霾清肺饮可能通过降低雾霾模型小鼠的炎性反应而发挥治疗定作用,且发现治疗效果优于预防效果,该产品可作为抗雾霾的有效功能饮品,具有广阔的市场前景。