富硒糙米蛋白理化特性及抗氧化活性的研究

冯明菊,熊 华,王晓雅,孙 永

(南昌大学食品学院,食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047)

硒(Selenium,Se)是人体生命活动所必需的微量元素之一[1],目前认为生物体内发挥生理功能的硒形态主要是以硒代半胱氨酸为活性中心的硒蛋白。研究表明硒蛋白具有抗氧化[2]、增强机体免疫[3]、抗癌活性[4]、抗肿瘤活性[5]、拮抗有害重金属[6]、保护与修复营养细胞[7],抑制砷、铅、镉等重金属诱导的动物组织损伤、炎症反应等生物活性功能[8-10],由此可见硒蛋白对机体是重要的也是必需的。然而,硒的可利用资源十分有限且分布相当不均匀。据调查,我国有约72%的缺硒或低硒地区[11],并且由于硒的缺乏引发许多的疾病,如克山病、大骨节病、心脑血管疾病等[12-13]。

大米作为我国居民膳食主粮之一,是重要的膳食硒来源。人们从谷物食品中获得的硒约占饮食中总硒含量的70%,且与人体硒营养状况密切相关[14]。因此,通过食物链途径强化硒元素,提高谷物中的硒含量,已成为目前功能性食品的研究热点之一。周鑫斌,Chen等[15-16]研究表明通过在土壤中或者叶面上施入适量的硒肥,利用水稻的生物富集和转化作用,可把无机硒转化为毒性低、安全有效的活性有机硒,提高大米中硒含量,改善糙米营养品质,被认为是一种低成本、安全、有效提高水稻硒含量的方法,已被广泛用于水稻中硒的富集。Fang等[17]研究发现,富硒大米中有机硒的主要存在形态是硒蛋白,且主要以硒代甲硫氨酸(selenomethionine,SeMet)形式存在,SeMet具有很高的生物活性。Liu等[18]通过碱提酸沉法提取糙米中的硒蛋白,探究其体外抗氧化活性,结果表明硒蛋白可显著清除机体内的超氧阴离子自由基、羟自由基和DPPH自由基,表现出较好的抗氧化活性。

本文主要以通过叶面喷施硒肥进行富硒处理后的三种富硒糙米为研究对象,探究三种富硒糙米中蛋白质、淀粉、粗脂肪、直链淀粉、脂肪酸含量的差异;通过碱提酸沉法提取富硒糙米蛋白并对其进行理化表征,包括蛋白质的分子量分布、氨基酸组成、红外光谱分析;同时测定硒蛋白的抗氧化活性(DPPH自由基清除率、羟自由基清除率、还原力),并与对照品VC进行比较,以期系统、全面地了解富硒糙米蛋白氨基酸组成、结构特征及生物活性,为进一步评价富硒糙米的营养价值、筛选优质的富硒糙米等提供理论依据,对富硒大米的生产、开发及应用具有指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

双江口富硒糙米(Shuangjiangkou selenium-rich brown rice,SSR)、桃源富硒糙米(Taoyuan selenium-rich brown rice,TSR)、麻阳富硒糙米(Mayang selenium-rich brown rice,MSR)、普通糙米(Ordinary brown rice,OR) 湖南省桃源县富硒产业基地提供;1,1-二苯基苦酰基苯肼(DPPH) 生化试剂,美国Sigma;铁氰化钾 分析纯,西陇化工;水杨酸 分析纯,国药集团。

AFS8230型原子荧光分光光度计 北京吉天有限公司;TU-1900型可见紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;S-433D型氨基酸分析仪 德国Skynm公司;Nicolet5700型傅里叶红外光谱仪 美国Thermo Nicolet 仪器公司;7890B型高效气相色谱仪 美国安捷伦公司;K9840型自动凯氏定氮仪 济南海能仪器股份有限公司;SPX-250型电泳仪 美国Bio-Rad 公司;DFY-500型粉碎机 浙江大德仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 糙米富硒处理 富硒糙米原料均通过叶面喷施硒肥的方式进行富硒处理,喷施的硒液浓度为40 mg/kg,孕穗期一次,灌浆期一次,均匀喷到叶面呈现雾滴状。

1.2.2 富硒糙米样品前处理 富硒糙米于烘箱中60 ℃烘干,用实验室规模的粉碎机磨粉后过100目筛,-20 ℃保存备用。

1.2.3 富硒糙米中营养成分的测定

1.2.3.1 蛋白质 蛋白质含量的测定方法参照GB 5009.5-2016 食品安全国家标准“食品中蛋白质的测定”中的凯氏定氮法[19],蛋白质换算系数为5.95。

1.2.3.2 淀粉 淀粉含量的测定方法参照GB 5009.9-2016食品安全国家标准 “食品中淀粉的测定”中的酸水解法[20],先测定出还原糖的含量,最后折算成淀粉含量。

1.2.3.3 粗脂肪 粗脂肪含量测定方法参照GB 5009.6-2016 食品安全国家标准“食品中脂肪的测定”中的索氏提取法[21]进行测定。

1.2.3.4 直链淀粉 参考郭天宇等[22]的方法,并稍作修改。称取过100目筛,且85%甲醇脱脂后的糙米样粉(100±0.5) mg,置于离心管中,加入 1.0 mL 95%乙醇及9.0 mL 1.0 moL/L NaOH溶液,轻摇均匀,置于沸水浴中加热10 min,取出冷却至室温后转移至100 mL容量瓶中,加水定容并剧烈振摇混匀。准确吸取5.0 mL样品溶液,加入已盛有一半蒸馏水的100 mL容量瓶中,加入1.0 mL 1.0 mol/L的乙酸溶液,摇匀后加入2.0 mL碘试剂,加水至刻度,摇匀,静置10 min。用5.0 mL 0.09 mol/L NaOH溶液代替样品做空白。在波长720 nm处测样品液的吸光值。用马铃薯直链淀粉和支链淀粉制备标准曲线,计算直链淀粉含量。

1.2.4 总硒含量的测定 糙米样品中硒含量的测定采用氢化物原子荧光光谱法(HG-AFS),参考Liu等[23]的方法,并做部分修改。将磨粉过筛的样品用正己烷脱脂,准确称量0.5 g(精确至0.001 g)样品于消化管中,加入5.0 mL硝酸,轻微振摇混合均匀,于微波消解仪中消化,消解结束待冷却后,将消化管转移至高温加热箱中继续加热至溶液变为清亮无色并伴有白烟出现,停止加热,切不可蒸干。待冷却后全部转移至25 mL容量瓶中,用超纯水定容,混匀待测,同时做空白对照。

1.2.5 有机硒含量测定 参考方建军等[24]方法,稍作修改。称取糙米干粉1.00 g,加少量超纯水后,在研砵中碾磨使细胞充分破裂,定量转移至事先准备好的透析袋中,用超纯水在烧杯中透析24 h,每 6.0 h离心更换一次超纯水,将透析后的样品取出,在离心机中12000 r/min离心15 min,取沉淀,冷冻干燥。准确称量0.5 g(精确至0.001 g)样品于消化管中,加入5.0 mL硝酸,轻微振摇混合均匀,于微波消解仪中消化,消解结束待冷却后,将消化管转移至高温加热箱中继续加热至溶液变为清亮无色并伴有白烟出现,停止加热,切不可蒸干。待冷却后全部转移至25 mL容量瓶中,用超纯水定容,混匀待测,同时做空白对照。

1.2.6 脂肪酸组成成分测定

1.2.6.1 糙米油脂的提取 参考喻凤香等[25]方法,稍作修改。称取糙米粉100 g,用500 mL正己烷分3次浸提,每次浸提2.0～3.0 h,旋转蒸发去除溶剂,收集油脂样品。

1.2.6.2 样品油脂甲酯化 参考喻凤香等[25-26]的方法,稍作修改。准确称取 2.0 mg油脂样品于10 mL玻璃试管中,分别加入1.5 mL正己烷,40 μL的乙酸甲酯和100 μL 0.5 mol/L的甲醇钠溶液,漩涡混匀,于37 ℃下水浴加热30 min,使其甲酯化,并适当振摇。取出后置冰箱冷却10 min,迅速加入60 μL饱和的草酸溶液,离心(4000 r/min,5.0 min)去除沉淀。取上清液过无水硫酸钠,氮吹至干。准确加入1.0 mL正己烷(色谱纯),摇匀,0.45 μm膜过滤,上样进行GC分析。

1.2.6.3 GC的测定条件 色谱柱为CP-Sil 88(100 m×250 μm×0.2 μm);检测器为火焰离子化检测器(FID);载气为H2(纯度≥99.999%);进样口温度为250 ℃;检测器温度为250 ℃;升温程序:起始温度45 ℃保持4.0 min,以3.0 ℃/min速率升到175 ℃,保持27 min,然后以4.0 ℃/min速率升到215 ℃,保持30 min;进样量为2.0 μL。

1.2.7 蛋白质的提取及蛋白硒含量测定 参考Liu[27],Fang[28]等方法,稍作修改。富硒糙米粉碎后过100目筛,正己烷(W/V=1∶3)搅拌脱脂6.0 h,通风橱过夜使溶剂挥发。称取脱脂富硒糙米粉适量,用0.05 mol/L NaOH(料液比=1∶20)在常温下搅拌提取3.0～4.0 h后,在4700 r/min下离心15 min,得到上清液,重复上述操作一次,合并上清液,用盐酸溶液调pH至5.4沉淀蛋白,然后在4700 r/min下离心15 min,得到蛋白质沉淀物,透析,冷冻干燥。提取的富硒糙米蛋白分别命名为双江口富硒糙米蛋白(SSRP),桃源富硒糙米蛋白(TSRP),麻阳富硒糙米蛋白(MSRP),普通糙米蛋白(ORP)。通过凯氏定氮测定蛋白纯度,按照1.2.4中的方法测定蛋白硒含量。

1.2.8 SDS-PAGE法测定分子量及亚基组成

1.2.8.1 制胶 按照SDS-PAGE试剂盒上各种胶配比分别配制12%分离胶,5.0%浓缩胶,其中TEMED和10%过硫酸铵最后加入,在加入前需混匀前面所加试剂。

1.2.8.2 电极缓冲液配制 称取3.0285 g Tris,14.41 g甘氨酸,1.0 g SDS,加蒸馏水充分搅拌溶解,定容至1000 mL,室温保存。

1.2.8.3 5×样品缓冲液 组成为25%(v/v)1.0 mol/L Tris-HCI(pH6.8),50%(v/v)甘油,0. 5%(w/v)溴酚蓝,10%(w/v)SDS和5.0%(v/v)β-琉基乙醇,小份(0.1 mL/份)分装,-20 ℃保存。

1.2.8.4 样品溶解 称取富硒糙米蛋白样品溶于样品缓冲液中,配制成浓度为2.0 mg/mL的样品溶液,样品溶解后于100 ℃水浴中加热5.0 min使其变性,取出,冷却至室温后于6000 r/min离心10 min,上清液即为电泳样品。上样前取上清液进行5倍稀释后即可上样,上样量为10 μL。

1.2.8.5 电泳 在室温条件下,开始时浓缩胶中的电流为恒流 15 mA,当样品完全进入分离胶后加大电流至 25 mA,直至样品嗅酚蓝条带移至距下端1.0 cm时,停止电泳。

1.2.8.6 染色与脱色 凝胶取出后于染色液中染色约1.0 h,取出用水小心冲洗去表面染色液,置于脱色液中于摇床上进行反复脱色,直至凝胶上背景色脱净为止结束。其中,脱色液为50 mL乙醇,75 mL冰醋酸定溶至1000 mL;染色液为0.25 g考马斯亮蓝R-250,50 mL乙醇,9.0 mL冰醋酸,加水定容至100 mL,过滤除去杂质。

1.2.9 傅里叶红外光谱分析 参照雷红灵[29]的方法,称取干燥后的富硒糙米蛋白样品和溴化钾按1∶100混合,研磨均匀,压制成薄片,用红外光谱仪进行扫描,绘制红外光谱图并进行对比分析。扫描的波数范围为400～4000 cm-1,扫描次数为32次,分辨率为4.0 cm-1,测定结果应扣除溴化钾背景光谱。

1.2.10 氨基酸的组成分析 准确称取富硒糙米提取蛋白0.1000 g,用6.0 moL/L HCL,110 ℃下加热水解22 h,用氨基酸自动分析仪测定氨基酸组成及各种氨基酸的质量分数。

1.2.11 富硒糙米蛋白的抗氧化活性

1.2.11.1 ·OH的清除能力的测定 本实验采用水杨酸法测定样品清除羟基自由基的活性。参考胡玲玲等[2]的方法,稍作修改。分别配制不同浓度的样品溶液。在试管中依次加入1.0 mL 9.0 mmol/L的硫酸亚铁溶液以及1.0 mL 9.0 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液,混匀,各加入0.1 mL不同浓度的样品溶液,最后加入1.0 mL 8.8 mmol/L的过氧化氢溶液启动反应,用蒸馏水定容至10 mL,漩涡混匀后在37 ℃水浴锅中反应15 min,以超纯水为参比物质,在510 nm 处测定吸光度,每组试验做三组平行对照,空白组中不加样品,对照组中用蒸馏水代替过氧化氢溶液,计算清除率。

式中:A0-空白组的吸光值;A2-加入样品的吸光值;A1-对照组的吸光值。

在实验中,选用了相同浓度的天然抗氧化剂抗坏血酸(VC)与硒蛋白的抗氧化活性进行对照,每种样品重复三次平行实验,取平均值。

1.2.11.2 1,1-二苯基苦酰基苯肼(DPPH)自由基清除能力的测定 参考Zhang等[30]的方法,稍作修改。用无水乙醇溶液配制1.0×10-4mol/L的DPPH溶液,4.0 ℃避光保存备用,现配现用。取2.0 mL不同浓度的硒蛋白样品溶液于试管中,加入2.0 mL配制好的DPPH溶液,漩涡混匀后,在室温条件下避光反应30 min,用无水乙醇作参比液,于517 nm处测定其吸光度值A2。对照组为等体积的蒸馏水与2.0 mL DPPH溶液的吸光度值A0,空白组A1为2.0 mL的待测样品与2.0 mL的乙醇溶液,每组试验做三组平行对照,计算清除率。以抗坏血酸作对比,分析对比不同含硒量糙米蛋白对DPPH·的清除能力。按下式计算DPPH·清除率:

表1 富硒糙米中硒含量及各营养成分含量Table 1 The content of selenium and nutritive components of selenium-enriched brown rice

式中:A2为DPPH溶液和样品溶液的混合溶液的吸光度值;A1为样品溶液的吸光度值;A0为DPPH溶液的吸光度值。

1.2.11.3 还原力的测定 本实验采用铁氰化钾法测定样品还原力。参考刘昆仑[5]等方法,稍作修改。取1.0 mL不同浓度的样品溶液于试管中,依次加入2.5 mL 0.2 mol/L的PBS缓冲溶液(pH6.6)和2.5 mL 1.0%的铁氰化钾溶液,漩涡混匀,50 ℃水浴20 min。取出后冰浴迅速冷却至室温,然后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液(TCA),振荡混匀,在3000 r/min下离心10 min。取上清液2.5 mL,加入相同体积的蒸馏水及0.5 mL 0.1%的三氯化铁溶液,混匀,于室温下暗处静置反应10 min,于700 nm处测定其吸光度值,每组试验做三组平行对照,以无水乙醇作参比溶液。以抗坏血酸作对照,评价不同含硒量糙米蛋白对三价铁离子的还原力。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 富硒糙米硒含量及各营养成分含量

许多研究表明[31-32],水稻对硒具有生物富集作用,在富硒农产品栽培过程中,通过叶面喷施硒肥会影响植物对硒的吸收利用,从而也会不同程度的影响到其它营养成分的积累。本实验通过氢化物原子荧光光谱法测得双江口富硒糙米(SSR)、桃源富硒糙米(TSR)、麻阳富硒糙米(MSR)、普通糙米(OR)中的硒含量分别为131.95±5.77、294.33±5.10、580.50±1.19、14.88±2.82 μg/kg。富硒糙米中的硒含量均显著高于普通糙米蛋白且三种富硒糙米中的硒含量存在显著性差异(P<0.05),此结果与Zhang[33]、Deng[34]等研究一致,即通过叶面喷施硒肥进行富硒处理可显著提高糙米中的硒含量,且不同品种糙米中硒富集量差异显著。这主要可能是由于不同品种的稻米对硒吸收和利用的效果不同,从而导致水稻籽粒中的硒含量不同[35]。

直链淀粉含量是评价糙米品质的一个重要指标之一,与蒸煮品质及食味品质的好坏有着密切的关系[36]。本实验利用马铃薯直链淀粉和支链淀粉绘制标准曲线(y=0.0091x+0.0152,R2=0.9994),测得SSR、TSR、MSR、OR中直链淀粉含量分别为14.67%、15.55%、15.99%、13.49%,富硒富硒糙米中直链淀粉的含量略高于普通糙米。

同时,由表1中可知,SSR、TSR、MSR、OR中脂肪、淀粉等营养成分的含量无显著性的差异(P>0.05),但蛋白质含量差异显著(P<0.05),SSR中的蛋白含量最高达9.02%,产生这一现象的主要原因可能是[37]:对水稻进行富硒处理时,由于品种之间的差异导致水稻对硒的富集及转化能力不同,而硒在转化过程中会与硫产生竞争作用,硒沿着硫的吸收和代谢途径取代了硫元素并与蛋白质中的半胱氨酸和蛋氨酸结合,形成了硒代氨基酸化合物,进一步被转运至水稻籽粒中以硒蛋白的形式贮存在蛋白质中,从而造成蛋白质含量存在显著性差异。此结果与Hu等[38],吴得峰[39],朱文东[40]的研究结果一致,即通过叶面喷施适量硒肥可提高大米中蛋白质含量,但对脂肪、灰分等含量影响不显著。

2.2 富硒糙米油脂中脂肪酸组成及含量

糙米油脂中含有多种脂肪酸,脂肪酸含量可作为评价糙米米粉酸败情况的质量指数。本实验采用浸提法提取糙米油脂,并对其进行了气相色谱分析,用面积归一化法测定其脂肪酸组分及含量,结果如表2所示:共鉴定出11种成分,其中SSR、TSR、MSR、OR中油酸、亚油酸及棕榈酸之和分别约占总脂肪酸含量的95.32%、95.70%、94.63%、91.74%,由此可见富硒糙米油脂中含有丰富的油酸、亚油酸及棕榈酸成分,其含量略高于普通糙米油脂,这一结果与Ramezanzadeh等[41]的研究结果一致。油酸、亚油酸比例均约为1.2∶1,接近国际卫生组织推荐的最佳标准1∶1;油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸含量高达76%左右,不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比列均约为3.2∶1;相较于普通糙米油脂,富硒糙米油脂中的肉豆蔻酸和硬脂酸含量差异显著(P<0.05),富硒糙米油脂中的肉豆蔻酸含量均低于OR,硬脂酸含量则与之相反;SSR、TSR、MSR中未检测出葵酸。此结果与喻凤香等[25]的研究结果一致,均证明米糠油是典型的油酸、亚油酸型植物油,其不饱和脂肪酸∶饱和脂肪酸≈4∶1,油酸∶亚油酸≈1.2∶1。

富硒糙米SSR、TSR、MSR油脂中各脂肪酸含量的变化可用脂肪酸合成与代谢的机理来进行解释。在脂肪酸合成途径中,丙二酸单酰辅酶 A(malonyl-CoA)作为重要的参与合成时的三碳单元中间体,其中,硫元素作为此辅酶的重要组成元素之一,若植物在生长的环境中存在着硒元素,硒与硫相互竞争,硒会取代硫元素与酶结合[42],结合后的硒降低了含硫酶的活性,从而造成糙米油脂中脂肪酸含量的变化;同时,在脂肪酸的代谢途径中,脂肪酸均是在酶的催化下通过β-氧化而降解,如不饱和脂肪酸是在烯酰-CoA异构酶(isomerase)和2,4-二烯酰-CoA(2,4-dienoyl-CoA reductase)的催化下进行β-氧化,而硒元素作为此两种酶的重要组成成分,影响酶的活性[43]。因此,在富硒糙米中,硒的存在有助于脂肪酸的组成和积累的改变。

表2 不同种类的富硒糙米油脂中脂肪酸组成及含量Table 2 Fatty acid composition and content of different varieties of selenium-enriched brown rice oil

2.3 蛋白质提取及纯度

本实验采取碱提酸沉法提取的ORP、SSRP、TSRP、MSRP糙米蛋白,其纯度分别为84.85%、88.66%、90.29%、87.46%,硒含量分别为0.074、1.35、2.97、6.38 mg/kg。由此可知,蛋白质中硒含量的变化与糙米中硒的变化一致(表1)且糙米中的硒主要与蛋白质结合。

表3 富硒糙米蛋白的纯度及硒含量Table 3 The purity and selenium content in differentvarieties of selenium-enriched brown rice protein

2.4 糙米蛋白分子量及亚基组成

采用 SDS-PAGE 法分析测定了富硒糙米蛋白及普通糙米蛋白分子量的分布及亚基组成,结果如图1 所示。分析比较ORP、SSRP、TSRP、MSRP的SDS-PAGE电泳图,由图1可以看出不同的糙米硒蛋白与普通糙米蛋白亚基条带基本一致,既没有蛋白谱带消失,也没有新的蛋白谱带产生,说明其亚基组成无明显差异,它们所包含的亚基结构几乎相同。同时,根据蛋白质分子量的分布,将这些条带分为六组,即Ⅰ-Ⅵ,其分子量的范围均在 10.0～70.0 kDa 之间,其中条带Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ为主要的亚基条带。研究结果表明,叶面喷施外源硒肥虽然会改变糙米硒蛋白的含硒量,但对蛋白质亚基的分布与组成不会产生影响,这主要由于硒被植物转运进入到植株内和果实中时,虽然会影响到糙米籽粒中蛋白质的含量,但不会改变蛋白质代谢的途径[44],故而不会改变蛋白质亚基的组成及分布。

图1 富硒糙米蛋白SDS-PAGE电泳图Fig.1 SDS-PAGE analysis ofselenium-enriched brown rice protein

2.5 蛋白质氨基酸组成

氨基酸作为蛋白质的基本组成单位,其成分分析是研究蛋白质结构特性和营养价值的重要手段之一。由表4可看出,三种富硒糙米及普通糙米蛋白氨基酸组成及含量基本相似,其中谷氨酸含量最为丰富,高达到14.87～17.02 g/100 g protein;其次是天冬氨酸、精氨酸和亮氨酸。ORP、SSRP、TSRP、MSRP中的必需氨基酸分别约占32.19%、33.17%、33.21%、33.67%。赖氨酸作为大米蛋白的第一限制氨基酸,仅约为3.14%～3.67%。E/T、E/N用于评估蛋白质的营养价值,各比值均相对稳定。与普通糙米蛋白相比,富硒糙米蛋白中的含硫氨基酸如半胱氨酸和蛋氨酸含量变化较为明显,这一结果与周遗品[37],Hu等[38]的研究结果一致,即通过喷施硒肥在提高稻米籽粒蛋白质含量的同时,也会降低半胱氨基酸含量、增大蛋氨酸含量。产生这一现象的主要原因是[45]:植物对硫和硒的吸收存在相互竞争作用,硒通过植物器官转运进入植物体内后会取代含硫氨基酸中的硫与含硫氨基酸结合,结合后形成的硒代含硫氨基酸化合物直接参与到植物蛋白质合成的过程中,从而造成植物体内的某些含硫氨基酸如半胱氨酸(Cys)和蛋氨酸(Met)含量的变化。

表4 富硒糙米蛋白氨基酸组成(g/100 g protein)Table 4 Amino acid composition of selenium-rich brown rice protein(g/100 g protein)

2.6 富硒糙米蛋白红外光谱分析

蛋白质在红外区有很多的特征吸收带:其中包括由C=O伸缩振动引起的酰胺I带(1700～1600 cm-1);由N-H弯曲振动引起的酞胺II带(1570～1500 cm-1)及对应波长于1350～1220 cm-1的酞胺III带。酰胺I带(1700～1600 cm-1)包含了蛋白质丰富的二级结构信息,如a-螺旋、β-转角、β-折叠、无规卷曲等,因此酰胺I带常用于解析蛋白质的二级结构。

对糙米蛋白在4000～400 cm-1范围内进行红外光谱分析扫描,其结果如图2所示。由图2A可知,三种富硒糙米蛋白及普通糙米蛋白的红外光谱图线基本相似,并未观察到新的特征峰,这说明糙米蛋白在进行富硒处理后未产生新的键。分析对比,硒蛋白的吸收峰位置略微红移。在波数3420 cm-1附近出现较强的吸收峰,这是由于酰胺基团中的N-H和分子间、分子内的-OH的伸缩振动所引起的。波数2926 cm-1附近出现的吸收峰是饱和烃中的C-H的伸缩振动产生的;在波数1640 cm-1左右出现窄而尖的吸收峰属于酰胺I带,是由C=O的伸缩振动产生的,是蛋白质的特征谱带。此外,在波数772、573 cm-1附近有一特征峰为对称环伸缩振动引起的,可能有Se=O、C-Se结构[46]。

图2 富硒糙米蛋白傅里叶红外(FT-IR)光谱图(A)和去卷积曲线拟合图(B)Fig.2 Fourier transform infrared spectrometerspectra(A) and deconvolution curve fitting diagram(B)of selenium-rich brown rice protein

图2A红外光谱的酰胺I带(1700～1600 cm-1)进行去卷积,其拟合结果如图2B所示:所有样品经二阶拟合均得到六个峰,与普通糙米蛋白相比,富硒糙米蛋白波峰明显发生了偏移。各峰的归属为1652 cm-1为α-螺旋,1610、1623 cm-1为β-折叠,1667、1684 cm-1为β-转角,1636 cm-1为无规卷曲[47]。各二级结构组分含量如表5所示:与普通糙米蛋白相比,富硒糙米蛋白中的β-折叠、无规则卷含量显著增加,β-转角、α-螺旋含量降低。而在三种富硒糙米蛋白中,SSRP与MSRP的各二级结构组分含量无显著差异;与SSRP和MSRP相比,TSRP中α-螺旋与β-转角含量较低,分别占14.89%、9.54%,然而无规则卷曲与β-折叠则与之相反,均在TSRP中含量最高,分别占29.44%、46.12%。这一现象表明,富硒处理后,三种富硒糙米蛋白质的二级结构发生了变化,各二级结构含量存在差异。这一结果与Hu等[48]的研究结果一致,Hu通过叶面喷施不同浓度(25、50、75和100 g Se/ha)的亚硒酸钠硒肥进行富硒处理,对提取的糙米谷蛋白进行FT-IR分析,结果表明富硒处理后谷蛋白的二级结构发生了变化。

表5 富硒糙米蛋白二级结构含量Table 5 Secondary contents of selenium-rich brown rice protein

2.7 富硒糙米蛋白抗氧化作用

2.7.1 DPPH自由基清除活性 如图3所示,富硒糙米蛋白SSRP、TSRP、MSRP与普通糙米蛋白ORP及VC均具有一定的DPPH自由基清除能力,富硒糙米蛋白与普通糙米蛋白对DPPH自由基的清除率与样品浓度均呈正相关关系,而VC对DPPH自由基的清除率随着浓度的增加基本保持不变。在本试验所测定的样品浓度范围内(0.1～1.0 mg/mL),相同浓度下,富硒糙米蛋白对DPPH自由基的清除率显著(P<0.05)高于普通糙米蛋白,这是因为硒以硒代半胱氨酸存在于酶的活性中心,特别是谷胱甘肽过氧化物酶[49],具有很强的抗氧化性,能有效清除DPPH自由基[50]。当样品浓度为1.0 mg/mL时,ORP、SSRP、TSRP、MSRP及VC对DPPH自由基的清除率分别为22.94%、38.72%、40.03%、41.56%、95.34%。此结果与胡玲玲等[2]的研究一致,均说明了进行富硒处理后的糙米蛋白具有更强的DPPH自由基的清除能力。

图3 富硒糙米蛋白对DPPH自由基的清除率Fig.3 DPPH free radical scavenging rate ofdifferent selenium-rich brown rice protein

2.7.2 羟自由基清除活性 图4结果表明,在本试验所测定的样品浓度范围内(0.1～1.0 mg/mL),富硒糙米蛋白SSRP、TSRP、MSRP与普通糙米蛋白ORP及VC对·OH都具有一定的清除能力,且清除率与样品浓度呈现正相关关系。当样品浓度在0.1～0.4 mg/mL范围内时,糙米硒蛋白对·OH的清除率随样品浓度的增加而急剧上升;当样品浓度在0.4～1.0 mg/mL范围内时,VC对·OH的清除率随浓度的变化趋于平缓,而硒蛋白对·OH的清除率随样品浓度的上升而缓慢增加,且当浓度为1.0 mg/mL时,OPR、SSRP、TSRP、MSRP及VC对·OH的清除率分别为36.05%、91.22%、89.41%、87.51%和99.88%。相同浓度下SSRP、TSRP、MSRP的·OH的清除能力差异很小,但均高于OPR。SSRP、TSRP、MSRP之间对·OH的清除作用无显著性差异(P>0.05)。

图4 富硒糙米蛋白对羟自由基的清除率Fig.4 Clearance rate of hydroxyl free radicalsin selenium-rich brown rice protein

2.7.3 还原力 由图5中可知,在本文所测定的样品浓度范围内(0.2～1.0 mg/mL),SSRP、TSRP、MSRP及VC对Fe3+均具有一定的还原力,且还原力随样品浓度的增加而呈上升趋势;当样品浓度为1.0 mg/mL时,ORP、SSRP、TSRP、MSRP及VC的还原力分别为0.312、0.341、0.368、0.357、1.966。三种富硒糙米蛋白的还原力显著高于相同浓度下的普通糙米蛋白的还原力(P<0.05),这可能是因为以硒代半胱氨酸形式存在于蛋白质中的硒,能有效除去起催化作用的金属离子[51],从而提高了蛋白的还原力。

图5 富硒糙米蛋白的还原力Fig.5 Reducing power of selenium rich brown rice protein

本研究结果表明,富硒糙米蛋白SSRP、TSRP、MSRP均显示了较强的DPPH自由基、羟自由基清除能力及还原力,且均高于普通糙米蛋白,此结果与刘昆仑[52]的研究结果一致。富硒糙米蛋白中结合了硒,形成了以硒代半胱氨酸为中心的硒蛋白,抗氧化能力显著增强,Xu等[53]、曹斌[54]的研究也报道了相似的结果,富硒蛋白具有较强的自由基清除能力与抗氧化活性。

3 结论

本文以富硒糙米为原料,对糙米和蛋白的理化特性及富硒糙米蛋白的抗氧化活性进行分析与测定。结果表明:富硒处理可显著(P<0.05)提高糙米中的硒含量及粗蛋白含量,造成肉豆蔻酸含量降低,硬脂酸含量升高;相较于普通糙米蛋白,富硒糙米蛋白中蛋氨酸含量上升,半胱氨酸含量下降;富硒处理对蛋白质分子量及亚基组成无显著影响,但会增加β-折叠、无规则卷含量增加,降低β-转角、α-螺旋含量。富硒糙米蛋白具一定的DPPH自由基、羟自由基清除能力与还原力,且均明显高于普通糙米蛋白,表现出了较强的体外抗氧化活性,可用于食品、医药等领域,为消费者提供新型食疗保健产品。