酶制备牡蛎蛋白水解物的抗氧化活性和功能特性分析

罗齐军 郑选梅 李红

摘要    为比较分析木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶3种不同酶水解牡蛎获得的蛋白产物抗氧化活性和功能特性，本文采用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶3种不同酶水解牡蛎蛋白获得水解物，并分别测定它们在不同pH值下的溶解度、乳化性以及不同浓度水解物的还原能力、DPPH自由基清除率和Fe2+螯合能力。结果表明，3种酶水解物都有较高的溶解度（P<0.01），胰蛋白酶产生的水解物溶解度最高，94.8%（P<0.05）;水解物溶解度和乳化活性指数在pH值为4时显著降低（P<0.05）。牡蛎蛋白质水解产物的还原能力、DPPH自由基清除能力和金属螯合活性随浓度的增加而增强，其中胰蛋白酶和胃蛋白酶的水解物抗氧化能力较强（P<0.01）。3种蛋白酶水解牡蛎蛋白可获得抗氧化活性强、溶解度高的水解物，并受浓度和pH值的影响，它们的水解物可作为一种潜在的抗氧化功能多肽利用。

关键词    牡蛎;蛋白水解物;抗氧化性;功能特性

中图分类号    TS254.1        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2020）15-0224-03                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）

Abstract    In order to analyze the antioxidant activities and functional properties of protein hydrolysates from oysters treated with papain， pepsin and trypsin， hydrolyzate was obtained by hydrolyzing protein of oysters with papain， pepsin and trypsin， the solubility and emulsifying ability were determined under different pH value， the reducing ability， DPPH free radical scavenging rate and Fe2+ chelation ability of hydrolysate with different concentrations were determined. The results showed that the solubility rate of three enzyme hydrolysates was higher （P<0.01）， and the hydrolysate produced by trypsin was the highest， reached 94.8% （P<0.05）， and the hydrolysate solubility and emulsifying activity decreased significantly when pH value was 4 （P<0.05）. The reducing ability， DPPH free radical scavenging ability and metal chelation activity of oyster protein hydrolysate increased with the increase of concentration， the hydrdysates treated by trypsin and pepsin had stronger antioxidant capacity （P<0.01）. Protein hydrolysates from oyster treated by three enzymes had high antioxidant activity and high solubility affected by the concentration and pH value. Hydrolysates obtained by these methods can be used as a potential antioxidant functional peptide.

Key words    oyster;protein hydrolysate;antioxidant;functional property

蛋白質水解物是一种源于动植物等天然蛋白经加酸或蛋白质水解酶加热水解并通过分离纯化后获得的产物[1]，有些水解物在其母蛋白序列中并无活性，释放出来才能表现其生理活性，这些水解产生的肽通常是2～20个氨基酸残基的长度，大多数包含二肽和三肽，研究发现在吸收和利用效率方面要比未水解的蛋白质和游离氨基酸更为优越[2]，因而其更能发挥营养作用。肠道以小分子肽的吸收为主，速度比氨基酸分子快[3]，因为小分子肽可以减少底物的竞争，其运载能力要比单个氨基酸强[2]。一些小分子肽如二肽和三肽经过内脏消化后不被酶解直接被吸收，而更长氨基酸链的多肽可能需要被酶解成小分子短肽才能被吸收[4]。除了营养作用外，一些不同蛋白质水解物还有其他重要的生物学活性，大量营养学或医学研究证明存在于动物、植物如大豆[5]、小麦面筋[6]、牛乳[7]、鱿鱼[8]、海参[9]、螺旋藻[10]等天然生物中的多肽或蛋白水解物具有生物活性，在抑菌、抗病毒、抗血栓、抗高血压、抗氧化、降胆固醇、延缓衰老以及免疫调节、神经和激素调节等方面发挥各种作用。

牡蛎属双壳贝类，肉中含有丰富的营养物质，其蛋白质含量高达50%[11]，氨基酸组成较完善，含有较高的必需氨基酸（高达40%），为公认的优质蛋白质，誉称之为“海中牛奶”。其也可作为传统医药学的药材，古代中医名著《本草纲目》中，记载牡蛎具有滋阴壮阳、降血压、减低胆固醇之功效，牡蛎被我国首批药食同源的保健疗效食品列入[12]，其具有很高的利用价值，尤其是其所含有的丰富的优质蛋白质，对人体健康具有很大的营养保健作用。因此，牡蛎蛋白是海洋生物活性肽的良好来源，其蛋白质水解物或多肽已被研究证明具有抗氧化[13]、抗菌[14]、抗肿瘤[15]和抗高血压活性[16]。但蛋白质水解物的功能特性因水解酶种类和水解条件不同而产生差异，作为优质的牡蛎蛋白在功能性水解物利用方面仍然存在不足。因此，本研究通过多种蛋白酶水解牡蛎蛋白获得牡蛎水解物，并比较分析它们的抗氧化活性和功能特性，为其在食品、保健品或药物等领域的利用提供参考。

1    材料与方法

1.1    试验材料

1.1.1    主要试剂。胰蛋白酶（1∶300）、木瓜蛋白酶（1∶2 000）、胃蛋白酶（1∶3 000），1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），均购置上海生生工程有限公司。

1.1.2    主要设备。JJ-2组织捣碎机（深圳国华仪器有限公司），DY89-II电动玻璃匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司），UV-2000紫外可見分光光度计（美国Unico公司），FE20K精密pH计（瑞士梅特勒托利多），3K30超速冷冻离心机（德国Sigma公司）。

1.2    试验方法

1.2.1    牡蛎蛋白水解物的制备。市售湛江沿海养殖鲜牡蛎，清洗干净后放置于50 ℃烘箱中干燥12 h，组织捣碎机粉碎后过200目得到干燥粉末。采用优化的蛋白酶解条件水解牡蛎粉末。分别将10 g牡蛎干粉悬浮于300 mL蒸馏水中，将混合物的pH值调至各种酶活性最佳值。木瓜蛋白酶处理混合物的水解条件为：pH值6.0，37 ℃，4 h，E/S（1∶100）;胰蛋白酶处理混合物的水解条件为：pH值8.0，37 ℃，4 h，E/S（1∶100）;胃蛋白酶处理混合物的水解条件为：pH值2.0，37 ℃，4 h，E/S（1∶100）。在水解过程中不断搅拌，并用1 mol/L HCl或NaOH不断调节至相应的pH值，水解反应4 h后将混合物在95 ℃水浴中保持15 min使酶失活终止水解反应。水解混合物在4 ℃离心（5 000 r/min）30 min，取上清液冻干后密封-20 ℃保存备用。

1.2.2    可溶性测定。将200 mg蛋白水解物样品溶解于20 mL去离子水中，并用HCl和NaOH（1 mol/L）将混合物调至不同的pH值（2、4、6、8）。在25 ℃将混合物搅拌30 min，离心（8 000 r/min，15 min）。参考Robinson等[17]改进的方法测定上清液中的蛋白质含量。在0.5 mol/L NaOH中溶解样品，测定样品的总蛋白质含量。蛋白质溶解度计算公式：溶解度（%）=上清液蛋白含量/样品总蛋白含量×100。

1.2.3    乳化性质测定。根据Pearce等[18]改进的方法测定乳化能力。10 mL花生油和30 mL 1%蛋白质水解产物溶液混合，并将所得油和蛋白质混合液分别调pH值至2、4、6和8。匀浆机混匀混合物（8 000 r/min），混匀后于0、10 min从容器底端吸取等分的乳液100 μL，并与10 mL 0.1%十二烷基硫酸钠溶液混合。500 nm波长下测量稀释溶液光密度。乳液形成后测得即光密度OD0和10 min光密度OD10，计算乳化活性指数和乳化稳定性指数：

乳化活性指数（m2/g）=（2×2.303×OD500）/（0.25×蛋白克数）;

乳化稳定性指数（min）=10×OD0 /（OD0-OD10）

1.2.4    还原能力测定。水解产物的还原能力根据Latorres等[19]方法测定。将不同浓度（1、3、5 mg/mL）的1 mL蛋白水解产物样品与2.5 mL磷酸盐缓冲液（pH值6.0，0.2 mol/L）和2.5 mL 1%铁氰化钾混合。于50 ℃条件下将混合物孵育（30 min），然后加入2.5 mL 10%（w/v）三氯乙酸。将混合物离心（3 000 r/min）10 min。最后将2.5 mL上清液与0.5 mL 0.1%（w/v）氯化铁混合，并加入2.5 mL蒸馏水。反应10 min后，700 nm波长测定所得溶液的光密度。

1.2.5    DPPH自由基清除能力测定。采用Latorres等[19]方法测定水解物清除DPPH自由基的能力。将各种浓度（1、3、5 mg/mL）的不同提取物乙醇1 mL溶液加到4 mL的0.004% DPPH甲醇溶液中。在孵育（25 ℃）30 min后，517 nm波长测光密度OD样品，用蒸馏水代替样品外，以相同的方式进行对照测得光密度OD空白，反应混合物的较低光密度表明较高的DPPH自由基清除活性。DPPH对自由基的抑制百分比（%）通过以下公式计算得出：自由基清除能力（%）=（OD空白-OD样品）/OD空白×100。

1.2.6    Fe2+螯合能力测定。使用Chalamaiah等[20]的改进方法测定了对Fe2+的螯合活性。分别将0.5、1.5、2.5 mg/mL的样品溶液与3.7 mL蒸馏水混合。然后使混合物与0.1 mL的2 mmol/L FeCl2和0.2 mL的5 mmol/L菲洛嗪反应，在室温下放置20 min。在562 nm波长测定光密度OD样品。蒸馏水代替样品外作为空白对照测得光密度OD空白，计算螯合活性：螯合活性（%）=（OD空白-OD样品）/OD空白×100

1.3    數据统计分析

测量数据均以均数±标准差（x±s）表示，数据用SPSS 13.0软件进行统计分析，显著性水平为P<0.05，极显著性水平为P<0.01。

2    结果与分析

2.1    牡蛎蛋白水解物溶解性

如图1所示，通过胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶作用牡蛎蛋白获得的牡蛎水解产物在pH值2～8范围内溶解度在77.8%以上，溶解度均高于未进行蛋白酶处理的样品（P<0.01）。在pH值为4时，这3种水解物溶解度相对较低。蛋白质水解物通常在等电点处溶解度低。在pH值为6～8时，这3种水解物显示出更高的溶解度（大于80.7%），可能是因为pH值对肽的弱酸性和碱性侧链基团上的电荷产生了影响。经胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶水解作用，产物溶解度显著提高（P<0.01）。通过蛋白酶水解小分子量多肽增加，极性基团的数量增多，蛋白质水解成小分子的肽更易溶解。蛋白水解物溶解性质是其利用的非常重要的功能特性，蛋白水解物的高溶解度更适合许多食品应用，也会影响起泡和乳化特性等[21]。

2.2    水解物乳化性质比较

不同pH值（2～8）牡蛎蛋白水解物的乳化活性指数和乳化稳定性指数如图2、3所示，水解物的乳化活性指数和乳化稳定性指数在pH值为4时最低（P<0.01），可能是因为溶解度降低的缘故。因在pH值为4时溶解度降低，蛋白质水解产物的乳化活性指数和乳化稳定性指数最低，而pH值远离4时这些指数增加。水解物的乳化活性指数和乳化稳定性指数也因水解酶种类而不同，胃蛋白酶水解物显示了较低的乳化活性指数。水解产物肽段中氨基酸组成可能不同，从而引起肽段的电荷变化。不同酶水解可能会影响乳化特性。未进行酶处理的样品表现了较高的乳化活性指数和乳化稳定性指数（P<0.01），认为是水解物小分子量的多肽不如具有较好的亲水和疏水基团作用力大，分子蛋白难以维持泡沫的形成和稳定[22]。

2.3    水解产物的还原能力

如图4所示，与未处理的牡蛎蛋白比较，水解产物的还原能力随浓度的增加而显著增强，且在胃蛋白酶和胰蛋白酶产生的蛋白水解物中有较高的还原能力（P<0.01），水解物可能是具氧化性物质的良好电子供体。牡蛎蛋白质水解产物可将Fe3+还原为Fe2+，随浓度的增加还原能力增加，这与Naqash等[23]报道的粉红鲈鱼蛋白水解产物的还原能力与浓度的变化相似。

2.4    DPPH自由基清除率

如图5所示，与未水解蛋白比较，蛋白酶产生的水解产物都表现出显著的清除活性（P<0.01）。在3 mg/mL和5 mg/mL的水解物浓度时DPPH自由基清除率较高，显示出最大的抗氧化活性。因此，牡蛎蛋白水解产物含有电子供体并且可以与自由基反应转化为更稳定的产物并终止自由基链反应。

2.5    Fe2+螯合能力

如图6所示，由3种蛋白酶获得的水解产物随浓度的增加金属离子螯合能力增强，尤其胰蛋白酶和胃蛋白酶获得的水解产物表现出显著的Fe2+离子螯合活性（P<0.01）。在较低的浓度（0.5、1.5、2.5 mg/mL）时，3种水解产物的螯合活性显示出显著差异（P<0.05），而在较高的浓度（1.5、2.5 mg/mL）下，胰蛋白酶和胃蛋白酶无显著性差异（P>0.05），但显著高于木瓜蛋白酶（P<0.01）。各种蛋白酶作用产生的肽可作为金属离子螯合剂，Chalamaiah等[24]认为蛋白水解物金属离子螯合活性可能是因水解产生大量的组氨酸残基引起，小分子肽可能会螯合一些金属离子氧化剂（如Fe2+和Cu2+），从而减少脂质氧化，并作为间接抗氧化剂起作用。铁和铜等金属离子是脂质过氧化作用的刺激物，多肽的螯合作用有助于延缓过氧化作用，可防止细胞和组织损害[25]。牡蛎蛋白水解物多肽具有较好的金属螯合能力，胰蛋白酶和胃蛋白酶表现尤为突出，是潜在可利用的抗氧化剂。

3    结论与讨论

试验表明，3种酶水解物都有较高的溶解度，其中胰蛋白酶产生的水解物溶解度最好;水解物溶解度和乳化活性指数均受pH值的影响。牡蛎蛋白质水解产物的还原能力、DPPH自由基清除能力和金属螯合活性反映水解物的抗氧化性质，随浓度的增加而增强，其中胰蛋白酶和胃蛋白酶水解物具有较高的抗氧化能力。因此，它们的水解物可广泛用于食品工业或保健品等领域。

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