商用益生芽孢杆菌的安全性分析

2020-08-16郭小华

中国畜牧杂志 2020年8期

刘纯，方莹，龙祝，胡佳，郭小华

（中南民族大学生命科学学院，武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，湖北武汉 430074）

芽孢杆菌是一类可以通过抗菌作用、生物夺氧等机制来保持肠道微生态系统平衡的有益微生物[1]，因此广泛应用于人类膳食补充剂和动物饲料添加剂。目前关于益生芽孢杆菌选育的研究大多以菌的体内体外益生特性为主[2]，较少系统关注芽孢杆菌安全性方面的问题。作为活菌使用，因其“溢出效应”，不仅会对机体构成安全性风险，还会导致潜在的致病性芽孢杆菌扩散到环境中，对公众健康造成危害[3]。芽孢杆菌的安全性风险主要包括耐药性以及潜在肠毒性，已经有许多关于芽孢杆菌对抗生素表现出耐药性并且其耐药基因由质粒编码的报道[1,4]。此外，益生芽孢杆菌具有产生肠毒素和呕吐毒素等代谢产物的可能性，会导致宿主产生腹泻及呕吐等不良反应，在蜡样芽孢杆菌作为益生菌应用时该问题尤为突出。应引起重视的是，地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌虽然一直被认为是“公认安全（GRAS）”的菌种，但在前期报道中陆续发现这两类芽孢杆菌也会产生肠毒素，存在潜在安全性风险[5]。本研究以6种商用微生态菌剂中的6株芽孢杆菌为研究对象，从药敏分析、耐药性质粒、耐药性基因和毒力基因的检测等方面来系统评估其安全性，为药用或者动物用益生芽孢杆菌的菌种选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株来源以市售的6种商用微生态制剂样品为基础，其标识所包含的芽孢杆菌分别为2种枯草芽孢杆菌、2种蜡样芽孢杆菌、2种地衣芽孢杆菌（为避免不必要的商业纠纷，在此隐去商品名；仅作为学术探讨用材料），本试验中分别命名为枯草芽孢杆菌的S-1和S-2、地衣芽孢杆菌的L-1和L-2、蜡样芽孢杆菌的C-1和C-2，对市售样品进行芽孢杆菌纯种分离和16S rDNA鉴定确认。分离的菌种置于20%甘油冻存管中-80℃保藏。菌株活化时，将保藏的菌种在LB培养基上划线得到单菌落，挑取单菌落接种到LB斜面培养基中，37℃培养24 h后于4℃冷藏备用。

1.2 培养基配制 LB培养基（1 L）：蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母浸粉5 g，pH为7.0左右；需要配制成固体LB培养基时，则在液体中加入1.5%的琼脂。

1.3 主要试剂和仪器抗菌药物药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司；AxyPrep质粒DNA小量试剂盒购自Axygen（杭州）；细菌基因组抽提试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；核酸浓度测定仪NanoDrop购自Thermo Fisher Scientific有限公司；PCR扩增仪T100TMThermal Cycler购自BIO-RAD；DNA Marker DL15000、DL5000、DL2000均购自TaKaRa（大连宝生物）；DYY-6C型电泳仪购自北京六一生物科技有限公司；JS-2012凝胶成像分析系统购自上海培清科技有限公司。

1.4 芽孢杆菌药敏分析选择四环素、环丙沙星、红霉素、氯霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、庆大霉素、卡那霉素、链霉素9种常用的抗生素进行药敏分析。分别取100 μL芽孢杆菌菌悬液涂布在LB平板培养基上，用镊子将不同抗生素试纸平贴于平板上，轻压使药敏纸片与培养基表面完全接触，37℃倒置培养12 h左右，通过测量抑菌圈直径判断各个菌株对于不同抗生素敏感性。每种药敏纸片进行3组平行试验，抑菌圈直径的测定基于3个平行试验的平均值。

1.5 细菌基因组DNA提取从各菌株斜面上刮取一环菌体分别接种于LB培养基，37℃培养12 h后，按照细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA，-20℃保存备用。

1.6 质粒的检测参照甘永琦等[6]方法，将药敏试验结果中的耐药菌株接种于LB培养基，并选择含质粒PET-28a的大肠杆菌和不含质粒TOP10的大肠杆菌分别作为阳性对照和阴性对照，37℃摇床过夜培养，采用少量质粒提取试剂盒提取质粒，用0.7%琼脂糖凝胶电泳检测质粒存在与否。

1.7 耐药基因的检测采用Adimpong等[7]方法，以药敏试验分析结果中耐药菌株的DNA为模板，根据特定的引物分别特异性扩增相关耐药基因ermA、ermB、ermC、msrA/B、ermD/K1a、ermD/K2a，用1% 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，以判定有无特异性目的条带。引物信息见表1。

1.8 毒力基因的检测采用Guinebretière等[8]与Tompkins等[9]方法，以6株芽孢杆菌的DNA为模板，根据特定的引物分别特异性扩增hblA、hblB、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC、cytK、bceT和ces10种毒力基因，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，以判定有无特异性目的条带。引物信息见表2。

2 结果与分析

2.1 各菌株抗生素敏感性测试如表3所示，这6株芽孢杆菌对大多数抗生素表现出敏感性，只有2株地衣芽孢杆菌的L-1和L-2表现出对红霉素耐药性。

2.2 耐药菌株中的耐药基因定位检测根据表3的结果，进一步对地衣芽孢杆菌L-1和地衣芽孢杆菌L-2的红霉素耐药基因进行定位，其质粒提取结果如图1，2株地衣芽孢杆菌菌株未检测到质粒条带，表明它们均不含有质粒，耐药基因不是质粒所编码。

以地衣芽孢杆菌L-1和地衣芽孢杆菌L-2的DNA为模板进行的红霉素耐药性基因PCR鉴定结果见图2，2株地衣芽孢杆菌均在染色体上携带有ermD/K1a（814 bp）1种红霉素耐药基因，未携带ermA、ermB、ermC、msrA/B和ermD/K2a5种红霉素耐药基因。

2.3 各菌株毒力基因检测对6株芽孢杆菌分别进行常见的特异性毒力基因PCR鉴定胶图如图3，最终的检测结果汇总到表4中。2株蜡样芽孢杆菌均携带hblA（1 154 bp）、hblB（2 684 bp）、hblC（740 bp）、hblD（829 bp）、nheA（755 bp）、nheB（743 bp）和nheC（683 bp）7种肠毒素基因，2株地衣芽孢杆菌均携带hblD（829 bp）、nheC（683 bp）2种肠毒素基因，枯草芽孢杆菌S-1携带hblD（829 bp）、nheC（683 bp）和cytK（809 bp）3种肠毒素基因，枯草芽孢杆菌S-2只携带hblD（829 bp）1种肠毒素基因（图3）。

表1 红霉素耐药基因引物信息[7]

表2 毒力基因引物信息[8-9]

3 讨论

益生菌的耐药性、是否产毒素是判定其安全性的2个重要方面[10]。已有研究证实，芽孢杆菌可通过接合或者以质粒的形式将耐药基因传递给其他细菌。Agersø 等[11]在蜡样芽孢杆菌中检测到四环素耐药基因tet（M）的存在，并能转移至枯草芽孢杆菌和肠球菌，可造成耐药性的传播。Dai等[12]在枯草芽孢杆菌中也发现了类似的案例，菌株质粒中携带四环素耐药基因tet（K），并可以转移至大肠杆菌。因此，在选用益生菌生产活菌制剂时，必须考虑是否具有耐药基因转移的风险。关于耐药性的一个重要要求就是益生菌不得含有编码耐药性基因的质粒[13]。在前期类似研究中，Sorokulova等[14]报道的地衣芽孢杆菌BL31具有对氯霉素和克林霉素的耐药性，但其不存在耐药质粒。李雪龙等[15]报道的地衣芽孢杆菌的耐药性基因也是由染色体编码。本研究中，6株益生芽孢杆菌中只有地衣芽孢杆菌L-1和L-2对红霉素有耐药性，耐药基因定位分析表明这2株地衣芽孢杆菌均不含有质粒，因而不具有通过质粒进行耐药性基因传播的可能性。本研究进一步确定了2株地衣芽孢杆菌产生的耐药性均是由在染色体上的一种红霉素耐药性ermD/K1a基因引起的，这种结果与Gryczan等[16]报道的地衣芽孢杆菌所具有的耐药性抗性基因一致。这些结果表明，大多数地衣芽孢杆菌的红霉素耐药性表型与ermD/K基因有关[17]。但这种基因也有可能编码在质粒上，如Adimpong等[7]研究发现地衣芽孢杆菌携带的ermD/K基因就是由质粒所编码。因此，在新选育的益生芽孢杆菌中，如果选育得到良好性能的芽孢菌株具有耐药性，一定要进一步做耐药性的基因定位，只有染色体基因编码的菌株才能保证益生菌的安全性。

益生芽孢杆菌中是否存在毒力基因并表达并产生毒素是安全性评价的另一重要方面。蜡样芽孢杆菌中可能含有肠毒素和呕吐毒素，这些毒素也可能存在于其他种的芽孢杆菌中[18-19]。与肠毒素相关的主要毒力基因有4个[8]，分别为溶血素Hbl、非溶血性肠毒素Nhe、细胞毒素K（CytK）、肠毒素T（BceT），其中编码溶血素Hbl的基因由1个操纵子组成，包括hblA、hblB、hblC和hblD4个基因，需要hblA、hblC和hblD3个基因均表达时才会产生溶血素。编码非溶血性肠毒素Nhe的3个组分的基因分别是nheA、nheB和nheC，这3个基因共表达时毒性最大。细胞毒素K具有细胞毒性，由cytK基因编码[20]。肠毒素T由bceT基因编码，已有研究证实肠毒素T没有生物活性，可能不参与肠毒性危害[21]。呕吐毒素主要由ces基因编码，它具有抗酸性环境，抗蛋白水解酶裂解及耐热的特点，危害较大。在前期芽孢杆菌安全性研究中，文英会等[22]在分离自饲料添加剂的蜡样芽孢杆菌中检测出呕吐毒素基因ces，Duc等[23]在来自于Bactisubtil、BiostudylDL和Subtyl益生菌制剂中的蜡样芽孢杆菌中均检测到hbl和nhe的肠毒素基因。Ahaotu等[24]研究发现蜡样芽孢杆菌B13b和蜡样芽孢杆菌A1均携带hbl和nhe基因。Stenfors[25]对26株蜡样芽孢杆菌的毒力基因nhe、hbl、bceT、cytK进行PCR检测，发现所有菌株都至少携带1个毒力基因；进一步的细胞毒性试验发现其中有17株菌可以产生毒素。类似的结果也出现在枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌中，Rowan等[26]在分离自奶粉中的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌中检测到了编码HBL的4个基因，并在进一步肠毒性验证结果中呈阳性。这些结果表明，芽孢杆菌携带毒力基因及产生毒素的几率较大。本研究中使用的6株益生芽孢杆菌均表现为呕吐毒素基因阴性，但所有菌株均检测为肠毒素基因阳性。虽然阳性的肠毒性基因检出并不意味着菌株一定产生肠毒性，需要结合具体的肠毒素进行进一步确认，但还是存在潜在的安全性风险，其中2株蜡样芽孢杆菌携带编码溶血素Hbl和非溶血性肠毒素Nhe的全部基因，其潜在安全性风险较其他4株菌株更大。需要注意的是，并非所有芽孢杆菌都携带毒力基因，Sorokulova等[14]在微生态制剂Biposporine®中的枯草芽孢杆菌BS3和地衣芽孢杆菌BL31均没有到检测hbl、nhe、bceT和cytK基因。因此，为了确保益生芽孢杆菌的使用安全，在对菌株选育时，一定要对其进行安全评估，对常见的毒力基因做广泛性筛查，并尽可能减少携带肠毒性基因的菌株使用。若候选菌株益生性能优良，需要根据阳性基因的检出情况，再对毒素的活性作进一步确认，以确保益生菌的使用安全。