黑羽番鸭CAPN1 基因的克隆及生物信息学分析

李 浩，胡志刚，陈 强，张慧林，刘小林*

（1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨陵 712100；2.陕西省潼关安大番鸭育种场，陕西潼关 714300）

番鸭具有生长速度快、瘦肉率高等众多优良品质，是十分优秀的肉鸭育种素材[1-2]，但其肉质极其粗糙，因此番鸭育种的目标是尽可能地改善肌肉嫩度。肉质嫩化受多种因素影响，是一个十分复杂的过程，其中关键肌原纤维蛋白的降解和肌纤维类型的转化发挥着举足轻重的作用[3-5]。CAPNs（钙蛋白酶，Calpains）是一个细胞内钙离子依赖性半胱氨酸蛋白酶家族，CAPN1（钙蛋白酶1，Calpains 1）是该家族的重要成员之一[6-7]。大量研究表明CAPN1基因在肌肉嫩化过程中发挥着关键作用[6-11]。此外，有研究表明CAPN1基因的多态性与肌内脂肪含量密切相关[8-9]。Cafe等[10]证明了牛CAPN1基因的多态性与肌肉嫩度密切相关。Kubota等[11]研究发现CAPN1基因与家鸡的体重、肌纤维直径、嘌呤含量等显著相关。综上，CAPN1基因在肌肉发育、嫩度调控以及肉的风味改善中发挥着重要作用，但国内外尚没有关于CAPN1基因在番鸭中的研究。本实验以黑羽番鸭为研究对象，对其CAPN1基因的编码区序列进行克隆；之后采用生物信息学方法进行同源性和系统进化分析，并对其蛋白的理化性质、亲疏水性、信号肽剪切位点、跨膜区、亚细胞定位、结构域、修饰位点及空间结构等进行预测，以期为进一步研究CAPN1基因功能和选育黑羽番鸭新品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 实验动物：本实验所用黑羽番鸭（黑番鸭）来自陕西潼关安大番鸭育种厂，选取1周龄黑番鸭，取指甲盖大小的腿肌。采集的组织样品在液氮中速冻，之后保存于-80℃冰箱中备用。

实验试剂：DEPC水（Biotopped，China），75%乙醇（用RNase-free ddH2O配置），inNova Uscript II First-Strand cDNA Synthesis SuperMix （AR121，innova gene），Q5 High-Fidelity DNA聚合酶（M0491，NEB），pMD18-T Vector Cloning Kit （NO.6011，TaKaRa），T4 DNA连接酶（EL0014，Thermo），E.coliDH5α感受态细胞（CW0808S，CWBIO），氨苄青霉素（A6140，Sigma），LB液体培养基，LB固体培养基，DL2000 DNA Marker（TSJ011-100,，TsingKe），DL5000 DNA Marker（TSJ012-100，TsingKe），SoSoo Cloning Kit（TSV-S1，TsingKe），Endo-free Plasmid DNA Mini Kit II（D6950-01，OMEGA），Gel Extraction Kit（D2500-01，OMEGA），TRIzol reagent（DP424,TIANGEN）、氯仿（500 mL，TIANGEN），异丙醇（500 mL，TIANGEN）。

1.2 引物设计 参考NCBI中收录的家鸭CAPN1基因的mRNA序列（XM_027447352.1），使用Primer Premier 5.0软件，参照PCR引物设计原则，利用同源重组原理将CAPN1基因的CDS序列分为CAPN1-a和CAPN1-b 2个片段分别设计引物扩增，引物序列见表1，由北京擎科生物公司进行合成。再设计菌液PCR引物（CAPN1-517），扩增大小为517 bp的片段，进行阳性克隆初步筛选。

1.3 RNA提取及检测 在RNA提取前1 d，将剪刀、镊子、研钵、研杵等器械全部清洗后，用DEPC水浸泡12 h，高压灭菌，之后放入烘箱中100℃烘烤8 h，待使用时用液氮预冷。所用到的各类试剂、枪头、离心管均要求无菌无酶。组织RNA提取采用Trizol法，按照试剂盒说明书进行操作。提取的RNA用1% 的琼脂糖凝胶电泳快速检测RNA的质量，并用超微量分光光度计检测其浓度和纯度，选取A260/A280值在1.8～2.0范围内且电泳带型完整的RNA用于后续实验。

1.4 反转录合成cDNA按照反转录试剂盒说明书进行操作，以适量RNA为模板、Oligo（dT）18为引物，在逆转录酶的作用下合成cDNA。

1.5 PCR扩增 以黑番鸭腿肌总RNA反转录的cDNA为模板，采用Q5高保真酶对CAPN1基因编码区进行PCR扩增，反应体系为50 μL：cDNA模板（200 ng/μL）1.0 μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各2.5 μL，Q5高保真酶（NEB）0.5 μL，5×high GC enhancer 0.5 μL，10Mm dNTPs 1.0 μL，5×Q5 Reaction Buffer 10 μL，加Rnase free ddH2O补足50 uL。PCR设定程序：98℃预变性5 min，然后进行35个循环（98℃变性30 s，62℃退火10 s，72℃延伸45 s），72℃后延伸2 min，最后4℃保存。

扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，切取目的条带，按照胶回收试剂盒说明书对PCR产物进行纯化回收。

1.6 重组、转化及阳性克隆鉴定 采用SoSoo重组克隆试剂盒，将纯化后的PCR产物（CAPN1-a、CAPN1-b）与pMD18-T载体连接，连接体系为10 μL：Linearlized pMD18-T Vector（50 ng/uL，0.03 pmol）1.0 μL，CAPN1-a（0.1～0.3 pmol）1.0 μL，CAPN1-b （0.1～0.3 pmol）1.0 μL，2× SoSoo Mix 5.0 μL，加水补足至10 μL。

加入相关组分后，用移液器轻轻吹打混匀，低速瞬时离心所有液体至离心管底部，50℃反应15 min。然后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂板在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养 12 h。随机挑取单克隆，用菌液PCR法和酶切质粒法筛选阳性克隆，将挑选的阳性克隆送北京擎科生物公司测序。

1.7 序列分析 对测序得到的序列使用DNAStar中的SeqMan软件进行序列拼接；使用NCBI中的ORF Finder工具查找开放阅读框；使用BLAST程序进行同源性比对；使用MEGA 7.0软件构建系统发育树；使用ExPASy ProtParam工具分析CAPN1蛋白的理化性质；使用ExPASy ProtScale工具分析CAPN1蛋白的亲疏水性；使用TEMpred工具对CAPN1蛋白的跨膜区进行分析；使用SignalP-4.0工具预测信号肽；使用TargetP 1.1 Server工具预测亚细胞定位；使用NetPhos 3.1 Server工具预测磷酸化位点；使用NetOGlyc 4.0 Server工具预测O-糖基化位点；使用NetNGlyc 4.0 Server工具预测N-糖基化位点；使用SOPMA工具分析CAPN1蛋白的二级结构；使用NCBI的CDD工具预测CAPN1蛋白的结构域；使用SWISS-MODEL工具预测CAPN1蛋白的三级结构。

表1 引物序列

2 结果

2.1 黑番鸭CAPN1基因CDS区克隆

2.1.1 PCR扩增 由图1可知，成功获得大小为1 103 bp和1 068 bp条带，目的条带清晰，无杂带，可用于后续实验。

2.1.2 阳性克隆鉴定 菌液PCR检测结果如图2所示，有2个菌落鉴定结果为阳性。

将这2个菌落分别加入到5 mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇菌培养12 h，用于提质粒。将提取的质粒用BamHI和HindIII进行双酶切后使用2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图3所示。由图3可知，1号和2号质粒经BamHI和HindIII双酶切后，均形成了2 692 bp和2 148 bp 2个片段，检测结果为阳性。将菌液PCR鉴定和质粒酶切鉴定均为阳性的克隆，送北京擎科生物公司进行测序。

2.2 生物信息学分析

2.2.1 序列拼接及ORF查找 对测序得到的序列使用DNAStar中的SeqMan软件进行序列拼接，拼接后得到一段长度为2 148 bp的序列。使用NCBI中的ORF Finder工具查找序列的开放阅读框，结果发现CAPN1基因含有一个长度为2 148 bp的开放阅读框，编码715个氨基酸（图4），将序列提交至GenBank，获得登录号为：MT419750.1。

2.2.2 同源性比对 同源性比对结果如表2所示，黑番鸭CAPN1基因核苷酸序列与鸭（Anas platyrhynchos）、鸡（Gallus gallus）、雉鸡（Phasianus colchicus）、人（Homo sapiens）、猪（Sus scrofa）、牛（Bos taurus）、绵羊（Ovis aries）、马（Equus caballus）的同源性分别为98.70%、87.29%、86.11%、81.89%、81.62%、81.18%、81.04%、81.27%；黑番鸭CAPN1基因氨基酸序列与鸭（Anas platyrhynchos）、鸡（Gallus gallus）、雉鸡（Phasianus colchicus）、人（Homo sapiens）、猪（Sus scrofa）、牛（Bos taurus）、绵羊（Ovis aries）、马（Equus caballus）的同源性分别为99.30%、91.47%、90.63%、83.22%、83.64%、83.10%、82.96%、83.36%（表3）。

2.2.3 系统发育分析 通过NCBI的GenBank数据库，检索并下载另外8个物种的CAPN1基因编码区（CDS）序列，连同测序得到的黑番鸭CAPN1基因编码区序列，使用MEGA 7.0软件进行系统发育分析，采用ML（最大似然法）建树，替换模型选择Tamura 3-parameter，替换速率服从Gamma分布，结果如图5所示，番鸭先与家鸭聚在一起，之后再与鸡、雉鸡聚在一起，最后与牛、羊聚在一起。

表2 黑番鸭CAPN1 基因核苷酸序列与其他物种的同源性比对

表3 黑番鸭CAPN1 基因氨基酸序列与其他物种的同源性比对

2.2.4 理化性质分析 由理化性质分析结果可知，亚细胞定位结果表明，黑番鸭CAPN1蛋白是线粒体靶向肽（mitochondrial targeting peptide，mTP）和分泌通路信号肽（secretory pathway signal peptide，SP）的概率分别是10%和12.7%，说明CAPN1蛋白无信号肽，不是分泌蛋白。CAPN1蛋白分布于细胞质中的可能性为56.5%，分布于细胞核中的可能性为17.4%，分布于线粒体中的可能性为26.1%，预测可信度为94.1%，所以，CAPN1蛋白可能主要分布于细胞质中。

2.2.8 修饰结构预测 对黑番鸭CAPN1蛋白可能的磷酸化位点进行预测，只有当氨基酸为丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸且阈值高于0.5时，才认为其是潜在的磷酸化位点，可知黑番鸭CAPN1蛋白共存在59个潜在的磷酸化位点，其中包括29个丝氨酸、8个酪氨酸、22个苏氨酸。

对黑番鸭CAPN1蛋白可能的N-糖基化位点进行预测，发现黑番鸭CAPN1蛋白共有3个潜在的N-糖基化位点，分别位于第127、310、469位氨基酸处。

对黑番鸭CAPN1蛋白可能的O-糖基化位点进行预测，发现黑番鸭CAPN1蛋白共有9个潜在的O-糖基化位点，分别位于第12、15、66、67、77、80、89、379、532位氨基酸处。

2.2.9 结构分析 CAPN1蛋白二级结构预测结果如图8所示，α-螺旋（Alpha helix，Hh）有301个氨基酸，占42.10%；β-转角（Beta turn，Tt）有52个氨基酸，占7.27%；延伸链（Extended strand，Ee）有115个氨基酸，占16.08%；无规卷曲（Random coli，Cc）有247个氨基酸，占34.55%；以上4种结构贯穿于整个氨基酸链，但α-螺旋占比最高，β-转角占比最低。

对番鸭CAPN1蛋白的结构域进行预测，结果如图9所示，CAPN1蛋白包含3个结构域，分别为钙蛋白酶催化结构域（Calpain catalytic domain，Peptidase_C2）、钙蛋白酶亚结构域III（Calpain subdomain III，Calpain_III）、钙调节蛋白结构域（Calpain domain，EFh_PEF_CAPN1）。

对黑番鸭CAPN1蛋白的三维结构进行预测，选择人m-Calpain II型晶体结构（SMTL ID：1kfu.1.A）为模板，该模板与目的蛋白序列的一致度为63.18%，可以用做CAPN1蛋白三维结构的预测，预测结果如图10所示。

3 讨论

肌肉嫩度是非常重要的肉质性状，肌原纤维结构、肌肉细胞完整性、蛋白分解酶活性，甚至是屠宰前、屠宰后的不同时间阶段等因素都会影响肌肉嫩度[4]。这些因素中关键肌原纤维蛋白的降解发挥着关键作用[12]。CAPN1基因是一种细胞内钙离子依赖性半胱氨酸蛋白酶，可以作用于肌原纤维以调控肌肉嫩度[13]。最初，CAPN1基因在肌肉蛋白降解过程中的作用在小鼠中被发现[14]。Geesink等[14]研究表明CAPN1基因敲除的小鼠表现出更强的蛋白积累能力。此后，Oliver等[15]再次验证了敲除CAPN1基因的小鼠在30周龄时，蛋白质积累能力显著高于对照组。Cheong等[16]研究发现CAPN1基因的3'UTR区域与肌肉大理石纹密切相关；Casas[17]等发现CAPN1基因会影响肉的风味；Xin等[18]证实了CAPN1基因与肌肉的pH、脂肪酸和氨基酸含量有关。CAPN1基因还被证实通过修改靶蛋白的一级和二级结构特征从而参与细胞运动、信号转导、凋亡、细胞分化和细胞骨架调控等重要过程[19]。目前，对于CAPN1基因的克隆在家猪[20]、鸡[21]、牛[22-23]、山羊[24]等物种中已有报道，但是尚没有关于番鸭CAPN1基因的研究。

本实验成功克隆了黑番鸭CAPN1基因的编码区序列。该序列包含一个2 148 bp的完整开放阅读框，共编码715个氨基酸，这与赵婧微[25]等克隆广灵驴CAPN1基因的结果一致。此外，已有研究结果表明牦牛[22-23]和山羊[24]的CAPN1基因编码区长均为2 151 bp，共编码716个氨基酸，与本实验研究结果相近；四川山地乌骨鸡的CAPN1基因编码区长度为2 115 bp，编码705个氨基酸[21]，这与本实验研究结果有较大差距。这些物种在核苷酸序列和氨基酸序列组成上的差异在一定程度上说明了亲缘关系的远近。理化性质分析和亲疏水性分析均表明CAPN1蛋白是亲水性蛋白。这与家猪[20]、鸡[21]、牛[22-23]、山羊[24]、广灵驴[25]、鲤[26]等动物中的研究结果一致，说明本实验结果可靠。信号肽是分泌蛋白特有的结构，极少超过45个氨基酸残基[27-28]。所以本实验只分析CAPN1蛋白N端70个氨基酸，结果表明番鸭CAPN1蛋白无信号肽，不是分泌蛋白，并且主要分布于细胞质中。这些结果同已报道的家猪[20]、鸡[21]、牛[22-23]、山羊[24]等动物CAPN1蛋白的预测结果完全一致。磷酸化和糖基化都是重要的蛋白质翻译后修饰过程，对蛋白质结构和功能具有重要作用[29-32]。本实验预测黑番鸭CAPN1蛋白存在3个潜在的N-糖基化位点。但是根据信号肽分析结果可知，CAPN1蛋白没有信号肽，所以不太可能暴露于N-糖基化机制，因此即使它们含有潜在的N-糖基化基序，在体内也可能不能被糖基化。蛋白质二级结构指蛋白质多肽链中形成的有规则重复的结构[34-35]。本实验对黑番鸭CAPN1蛋白二级结构的研究结果与广灵驴[25]中的研究结果相近，但与鲤[26]的研究结果不一致，可能是因为番鸭与广灵驴在亲缘关系上较近，与鲤在亲缘关系上比较远。结构域预测发现黑番鸭CAPN1蛋白包含3个结构域，其中钙蛋白酶催化结构域包含催化位点，属于CysPc超家族，位于第56～352位氨基酸处；钙调节蛋白结构域包含Ca2+结合位点，属于EFh_PEF超家族，位于第547～715位氨基酸处；钙蛋白酶亚结构域III属于Calpain_III超家族，位于第373～520位氨基酸处，有酸性环，将催化结构域和调节结构域连接起来。

4 结论

本实验成功克隆了黑番鸭CAPN1基因CDS序列，得到一个长度为2 148 bp的片段，编码715个氨基酸，将序列提交至GenBank，获得登录号为MT419750.1。生物信息学分析确定CAPN1蛋白是亲水性蛋白，主要分布于细胞质中，不是分泌蛋白，无信号肽，有3个保守结构域和4种二级结构。CAPN1蛋白虽有潜在的N-糖基化序列，但不能发生N-糖基化修饰。本实验结论为进一步研究CAPN1基因功能和选育黑羽番鸭新品种提供理论依据。