卵黄在湖羊精液常温保存中的作用效果

张柳明，Tariq Sohail，马金亮，冯云奎，褚长江，李拥军

（扬州大学动物科学与技术学院，江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室，江苏扬州 225009）

湖羊（Hu sheep）是世界著名的多胎绵羊（Ovis aries）品种，具有四季发情、一年两胎和生长发育快等优点。人工授精技术是家畜繁殖中的一项基本技术，能够充分利用优良种公畜的精液[1-3]。精液保存则是人工授精技术中的关键环节，精液保存通常分为常温保存、低温保存和冷冻保存[4-5]。在实际生产中，精液保存大多采用常温保存，其具有处理操作过程简单和无需特殊的控温设备等优点。精液的低温保存和超低温冷冻保存通常都添加卵黄，在猪、狗和兔等物种的精液稀释液中也都有添加应用[6-7]。不同的卵黄（如鸡蛋、鸭蛋等）在不同哺乳动物的精液保存中也都有应用[8]。卵黄中的低密度脂蛋白聚集在精子膜表面，减少了精子的冷休克，在精液冷冻保存中发挥了关键作用[9]。除此之外，卵黄可以调节稀释液中的渗透压和电解质浓度，使其环境适宜精液保存，延长了精子存活时间[10]。

在湖羊精液的常温保存中添加卵黄鲜有报道。本实验使用添加不同浓度卵黄的稀释液对湖羊精液进行常温保存，采用计算机精子辅助分析仪（CASA）对精液保存期间的活率、活力以及一些运动参数进行检测，旨在客观评价卵黄对湖羊精液常温保存的效果，以期为湖羊精液保存技术在生产中的推广应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器设备 Tris、柠檬酸、果糖均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；青霉素钠、链霉素硫酸盐均购自源叶生物（上海）科技有限公司。迈郎精子全自动分析系统（CASA）购自南宁松景天伦生物科技有限公司；电热恒温水浴锅购自上海精宏实验设备有限公司；恒温箱购自于慈溪市城康电器有限公司。

1.2 实验精液 本实验所用精液为扬州大学实验羊场的3只1～2岁健康湖羊的混合精液，其体型外貌良好，精液品质良好，成年公羊每周采集精液3次。

1.3 精液稀释液的配制 准确称取Tris 15.35 g、柠檬酸8.20 g、果糖10.00 g，溶解于500.00 mL灭菌超纯化水中，充分混匀，使用0.22 μm滤膜过滤除菌，之后加入青霉素、链霉素各25万IU，配制成基础稀释液。分别取100、95、90、85、80 mL基础稀释液，用5 mL注射器向其中分别添加0、5、10、15、20 mL卵黄。将稀释液放入冰箱过夜使其充分溶解，然后10 000 r/min，4℃条件下离心20 min，离心后将上清液分装即得到卵黄浓度分别为0（对照组）、5%、10%、15%、20%的稀释液，置于4℃冰箱保存，待用。

1.4 精液的采集和处理 采用假阴道法采集公羊精液，采精结束后放入37℃保温杯中，1 h内带回实验室。选取色泽乳白、无异常气味和射精量正常的精液，使用计算机辅助精液分析系统（CASA）来检测精子活力，选择精子活力在75% 以上的精液用于后续实验。将合格的精液混匀，使用1.5 mL离心管，每管分装130 μL精液，用已经37℃预热的不同卵黄浓度的稀释液稀释10倍，然后用多层棉花包裹，置于16℃恒温箱中保存，每隔24 h针对各项指标进行检测。

1.5 精子质量检测 每隔24 h从10倍稀释保存的各个离心管中取出20 μL精液，使用0.9%的生理盐水再次稀释5倍，置于37℃水浴锅孵育2 min后，采用CASA检测精子活率、活力以及运动参数。

1.6 统计分析 利用SPSS 25.0软件对实验所得数据进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），处理结果以平均值± 标准差表示。每组设3个重复，P＜0.05表示差异显著，P＞0.05表示差异不显著。

2 结果分析

2.1 在常温保存下不同浓度卵黄对湖羊精子活率的影响由表1可知，保存24～72 h，5% 和10% 卵黄组的精子活率较对照组有所提高（P＞0.05），15% 和20% 卵黄组精子活率降低（P＞0.05）；保存96 h，5%、10% 和15% 卵黄组精子活率提高（P＞0.05），20% 卵黄组精子活率降低（P＞0.05）；保存120～240 h，各卵黄添加组精子活率均有提高且在144～216 h存在显著差异。

保存24～72 h、120～144 h，5%卵黄组的精子活率最高且在24～72 h时显著高于15% 和20% 卵黄组，在120～144 h显著高于对照组；保存96 h，10%卵黄组的精子活率最高且显著高于20% 卵黄组；保存168 h，15%卵黄组的精子活率最高且显著高于对照组和5%卵黄组；保存192～240 h，20%卵黄组的精子活率最高且显著高于对照组、5%和10%卵黄组。

2.2 在常温保存下不同浓度卵黄对湖羊精子活力的影响 由表2可知，保存24～96 h，与对照组相比，5%和10%卵黄组精子活力提高，15%和20%卵黄组精子活力降低；保存120～240 h，各卵黄添加组精子活力均有提高且在144～216 h存在显著差异。

保存24～72 h、120～144 h，5% 卵黄组的精子活力最高且在24～72 h显著高于15%和20%卵黄组，在120～144 h显著高于对照组；保存96 h，10%卵黄组的精子活力最高且显著高于20%卵黄组；保存168～192 h，15%卵黄组的精子活力最高且显著高于对照组和5%卵黄组；保存216～240 h，20%卵黄组的精子活力最高且显著高于对照组、5% 和10% 卵黄组。对照组的精子活力从96 h开始快速下降，5%卵黄组从120 h开始快速下降，10% 和15% 卵黄组从168 h开始快速下降，20%卵黄组的精子活力下降相对平稳。

2.3 在常温保存下不同浓度卵黄对湖羊精子运动性能的影响 由表3可知，保存72 h，5%卵黄组的精子直线速率最高（P＞0.05）；保存96 h，10% 卵黄组的精子直线速率、曲线速率、路径速率和侧摆幅度最高且显著高于对照组和其余添加组；保存120 h，20%卵黄组的精子直线速率、曲线速率、路径速率和侧摆幅度最高且显著高于对照组和5% 卵黄组；保存192 h，15% 卵黄组的精子直线速率、曲线速率、路径速率和侧摆幅度最高且显著高于对照组和5% 卵黄组；保存216 h，20%卵黄组的精子直线速率、曲线速率、路径速率和侧摆幅度最高且显著高于对照组、5%和10%卵黄组，且此时的线性度和前向性也最高（P＞0.05）；保存96～240 h，各卵黄组均提高了精子的直线速率、曲线速率、路径速率和侧摆幅度且在120～240 h存在显著差异。

表1 在常温保存下不同浓度卵黄对湖羊精子活率的影响 %

3 讨论

卵黄中的主要物质包括卵磷脂、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白，其中卵磷脂和低密度脂蛋白对精液保存起到保护作用，高密度脂蛋白会影响精液保存效果[11-12]。卵黄是大分子非渗透性缓冲物质，被精子膜阻挡在细胞外，但其可以调节稀释液中其他物质的生物活性，有益于精液保存[13]。此外，卵黄作为一种营养物质和抗冻保护剂，能够为精子的代谢活动提供能量，维持精子的活力、保证精子膜的稳定性和完整性以及保护顶体的完整性[14-15]。卵黄中的高密度脂蛋白可以使精子膜中的胆固醇丢失，改变磷脂层的流动性，增强精子对低温打击的敏感性。同时有报道称尿道球腺产生的一种蛋黄凝固酶会与卵黄发生相互作用，不利于精液保存[16-17]。在稀释液中添加卵黄存在一定的风险，因为卵黄是动物源性的添加物质，可能存在生物学感染，其中可能会含有病毒、毒素等[18-19]。卵黄来源的畜禽品种、饲养条件等差别较大，可能会存在性能不稳定的情况。

表2 在常温保存下不同浓度卵黄对湖羊精子活力的影响 %

表3 在常温保存下不同浓度卵黄对湖羊精子运动性能的影响

目前，湖羊精液的液态保存已经进行了多方面的研究，目前湖羊精液研究较多的是低温保存和超低温冷冻保存，在常温保存上鲜有报道[20-21]。相比于低温保存，精液常温保存对精子代谢和细菌的抑制性更低，低温保存的精液其保存时间更长[22-23]。相比于常温保存，精液低温保存的稀释液配方和操作过程更为复杂，不利于推广应用，而且低温保存可能会对精子膜产生一定影响，同时低温保存也有可能引起受精能力的降低和胚胎丢失率的增加[24-26]。本研究结果表明，添加卵黄可以提高精液品质，延长有效存活时间和总存活时间，使精子活力、活率等缓慢下降，尤其在精液保存后期发挥了有益作用。

国内外关于卵黄在不同物种或者不同的精液保存方式中有较多报道。刘新峰等[27]在对驴精液常温保存的研究中发现，15%卵黄添加量对精液的保存效果最好。Bispo等[28]在对山羊精液超低温保存的研究中发现，2.5%的卵黄添加量对解冻后精液品质最好。朱海鲸等[29]研究发现，添加13.5%卵黄时陕北白绒山羊精液冷冻保存效果最佳。胡传水[30]研究发现，添加20%卵黄时猪精液常温保存效果最佳。本实验中，虽然物种不同，采用的保存方式可能不同，但是添加卵黄提高了湖羊精液常温保存过程中的精液品质，延长了精子的存活时间，使精液品质缓慢改变，与上述研究结果相一致。杨灿锋等[31]研究结果表明，稀释液同时添加糖类和卵黄时，若卵黄添加量过大，会降低精液品质。这一研究结果与本实验中添加15%和20%卵黄降低了前期精子活力相一致。直线速率、曲线速率、路径速率和侧摆幅度指标是描述精子速度的单个变量，与繁殖性能关系密切[32]。直线速率、曲线速率和路径速率是评价精子运动性能的关键指标，受精能力与其成正比[33]。Liu等[34]研究显示，侧摆幅度和鞭打频率与精液品质存在显著关系。本实验中直线速率、曲线速率、路径速率和侧摆幅度与精子活力呈正比，其他运动指标与精子活力之间不存在相关关系。

本实验发现卵黄对湖羊精子具有双重作用。在精液保存初期，低浓度卵黄可以提升精液品质而高浓度卵黄降低了精液品质，这可能是由于高浓度卵黄改变了精子的生存环境，使渗透压等条件发生改变[30,35]；在精液保存中后期，卵黄添加组都可以提升精液品质，而高浓度的卵黄效果更好，这可能是在保存过程中随着糖类营养物质的消耗，卵黄逐渐为精子代谢活动提供能量，进而延长了精液的保存时间，改善了精液品质，也可能是由于卵黄中的卵磷脂和低密度脂蛋白黏附在精子膜表面，保护了膜的完整性，降低了随着时间推移精液中产生的有害物质（如代谢废物、细菌以及一些活性氧对精子）的损害作用[36-37]。

4 结论

本实验结果表明，不同浓度卵黄在常温保存条件下在不同时间段对湖羊精液的保存效果不同。保存初期高浓度卵黄降低了精液品质，但后期添加不同浓度卵黄均提高了精液品质，延长了精子存活时间。在保存144 h内，添加5%卵黄对湖羊精液的常温保存效果最好；保存144～216 h，添加15%卵黄对湖羊精液的常温保存效果最好；保存216 h后，添加20% 卵黄对湖羊精液的常温保存效果最好。