乳杆菌联合壳聚糖季铵盐对奶牛子宫内膜上皮细胞炎症的影响

2020-08-16向炬富刘红羽王政业吕文发

中国畜牧杂志 2020年8期

向炬富，刘红羽，赵静，鄢冉，王政业，王军*，吕文发*

（1.吉林农业大学动物生产与产品质量安全教育部重点实验室，吉林长春 130118；2.现代农业技术教育部国际合作联合重点实验室，吉林长春 130118；3.长春职业技术学院现代农学院，吉林长春 130118；4.长春市九台区动物卫生监督所，吉林长春 130118）

奶牛子宫内膜炎是临床上常见的繁殖障碍性疾病之一，主要是由于奶牛产后生殖道扩张、病原微生物持续侵入感染发病，如致病性大肠杆菌（EPEC）。大肠杆菌通过黏附于子宫内膜上皮细胞激发相关炎症通路，从而导致大量细胞因子（IL-6、IL-8和IL-10）释放[1-2]。子宫内膜炎常导致母畜妊娠中断、屡配不孕，严重时可致使奶牛繁殖能力丧失，造成大量经济损失。对于大肠杆菌引起的奶牛子宫内膜炎，临床上主要的治疗方法是应用抗生素，但长期使用会引起药品残留、环境污染等问题[3-4]。乳酸菌制剂已被证明具有抗炎和提高机体免疫力的潜力，有望替代抗生素成为治疗奶牛子宫内膜炎的新一代药剂[5]。有研究表明，乳酸菌的益生作用主要表现在与病原菌的营养竞争，以及代谢产物的抑菌作用[6]。乳酸菌通过强力附着于奶牛子宫内膜上皮细胞，可以更好且持续地发挥其益生效果[7]。壳聚糖及其衍生物常被用于药物的载体，可运载细菌特异性靶向目的细胞，且已被证明具有一定的抗炎作用[8-9]。为挑选出能够有效抵御大肠杆菌的乳酸菌，有研究表明从健康奶牛子宫内分离的乳酸菌能够生产抑菌的有效物质[10]。为进一步探究乳酸菌对细胞炎症的影响，本研究挑选了3株分离自健康奶牛子宫的优势乳杆菌，即魏斯氏乳杆菌（L.weissella）、唾液乳杆菌（L.salivarius）和约氏乳杆菌（L.johnsonii），研究其对奶牛子宫内膜上皮细胞炎症的影响，并探究其与壳聚糖季铵盐（Chitosan Quaternary Ammonium Salt，CQN）的联合作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料 MRS培养基和LB培养基均购自赛奥克生物科技有限公司。DEPC水、胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM/ F-12（1:1）均购自上海生工生物工程有限公司。Trizol、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII均购自大连TaKaRa公司。

1.2 细胞培养将冻存的奶牛子宫内膜上皮细胞系（ATCC提供）置于37℃水浴锅中快速复苏，然后添加含10% 胎牛血清的细胞培养液，置于5% 二氧化碳培养箱37℃培养。细胞计数，每个大皿达到20万个即可分组处理。

1.3 细菌培养约氏乳杆菌、唾液乳杆菌、魏斯氏乳杆菌和致病性大肠杆菌均由本实验室提供。将冻存的3株乳杆菌放至室温，用接种环蘸取菌液在MRS固体培养基上连续划线，恒温箱37℃培养24 h后用接种环挑取单菌落于MRS液体培养基中培养12 h达1010CFU/mL，纯化3次后予以备用。将冻存的大肠杆菌放至室温，用接种环蘸取菌液在LB固体培养基上连续划线，恒温箱37℃培养24 h后用接种环挑取单菌落于LB液体培养基中培养8 h达1010CFU/mL，纯化3次后予以备用。

1.4 细胞活力检测将不同浓度的大肠杆菌（105、106、107、108CFU/mL）悬浮于含1%胎牛血清的无双抗培养液中处理细胞24 h。称取1 g壳聚糖季铵盐（北京酷尔化学科技有限公司提供）溶于100 mL纯水，梯度稀释至10、1、0.1、0.01、0.001 mg/mL后处理细胞24 h。按照乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司提供）说明书操作，检测大肠杆菌处理和乳杆菌处理对细胞活力的影响。

1.5 奶牛子宫内膜上皮细胞炎症模型建立大皿细胞培养至20万个，添加105CFU/mL和106CFU/mL的大肠杆菌悬液分别处理3、6、9、12、24 h，收集上清液，ELISA盒子（上海酶联提供）检测细胞因子IL-6和IL-8的变化以确定炎症的发生。

1.6 细胞因子分析细胞炎症模型建立完成后，分组进行不同处理。对照组：正常培养的细胞；E.coli组：106CFU/mL大肠杆菌处理3 h致炎；LAB组：致炎后单独添加108CFU/mL乳杆菌处理12 h；CQN组：致炎后单独添加0.01 mg/mL壳聚糖季铵盐处理12 h；LAB+CQN组：致炎后添加乳杆菌和壳聚糖季铵盐混合处理12 h。处理完毕后3000 r/min离心10 min后取上清，按照说明书进行操作，ELISA盒子（上海酶联生物科技有限公司提供）检测细胞因子IL-6、IL-8和IL-10的变化。

1.7 RT-qPCR分析细胞处理后弃上清，PBS冲洗3次，Trizol法提取细胞RNA，然后按照试剂盒要求（PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser）对提取的样本RNA进行反转录，荧光定量PCR法检测IL-6和IL-8的mRNA表达。荧光定量PCR反应体系：10 μL GreenTMPremix Ex TaqTMII，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，0.4 μL ROX reference Dye II，2 μL cDNA。荧光定量PCR所需引物见表1。

表1 荧光定量PCR引物信息

1.8 细菌黏附检测将细胞爬片（φ15 mm，NEST）置于24孔板中，分别加入等量的细胞过夜培养，不同处理后进行革兰染色，油镜下观察细菌黏附情况。PBS冲洗3次后用胰蛋白酶将细胞吹落，稀释涂布平板进行细菌计数，黏附率表示为每个细胞黏附的细菌数（CFU/个）。

1.9 统计分析采用Graghpad Prism 5.0统计软件进行单因素方差分析，所有结果均表示为平均值±标准差，P＜0.05表示差异具有统计学意义，P＞0.05表示差异没有统计学意义。

2 结果

2.1 大肠杆菌和壳聚糖季铵盐对细胞活力的影响通过对LDH释放量的检测来评估大肠杆菌和壳聚糖季铵盐对奶牛子宫内膜上皮细胞活力的影响。由图1-A可得，107、108CFU/mL的大肠杆菌对细胞均有显著的损伤作用；而105、106CFU/mL的大肠杆菌无明显损伤作用。由图1-B可得，添加10、1 mg/mL的CQN极显著降低了细胞活率，而0.1、0.01、0.001 mg/mL的处理并未对细胞显示出损伤影响。

2.2 大肠杆菌诱导细胞炎症发生选择105CFU/mL和106CFU/mL的大肠杆菌处理细胞，通过评估细胞因子的变化来确定炎症的发生。如图2所示，添加105CFU/mL的大肠杆菌处理6 h后，炎性因子IL-6（P＜0.05）和IL-8（P＜0.01）的分泌量均上升；而添加106CFU/mL的大肠杆菌处理3 h后即可观察到炎性因子的显著上升，且在24 h内持续升高。结果表明，105CFU/mL的大肠杆菌处理6 h后或106CFU/mL的大肠杆菌处理3 h后，均可引起奶牛子宫内膜上皮细胞的持续性炎症。

2.3 不同处理对细胞因子的影响如图3所示，单独添加魏斯氏乳杆菌、唾液乳杆菌和约氏乳杆菌处理均显著降低了细胞因子IL-6的蛋白和mRNA表达（图3-A、B），但对趋化因子IL-8的表达无显著影响（图3-C、D）。单独添加CQN处理也显著降低了IL-6的表达，而对IL-8无影响。约氏乳杆菌加CQN混合处理同时降低了IL-6和IL-8的表达（P＜0.05），而其他乳杆菌加CQN混合处理的抑炎效果并不明显。IL-10是体内的抑炎因子，炎性因子IL-6、IL-8与其比值反映了体内细胞因子的平衡。相比其他处理组，约氏乳杆菌加CQN混合处理使得细胞因子的平衡恢复至常态，具有较好的抗炎效果（图3-E、F）。

2.4 细菌黏附的变化通过对细菌黏附的检测观察到，CQN的添加极显著提升了约氏乳杆菌的黏附率（P＜0.001），但约氏乳杆菌和CQN混合处理并没有显著降低大肠杆菌的黏附率（图4）。

3 讨论

奶牛子宫内膜上皮细胞作为抵抗病原菌侵染的第一道防线，对机体健康有着非常重要的作用[11]。大肠杆菌侵染内膜上皮细胞引起奶牛子宫内膜炎，从而阻碍受精和胚胎植入，甚至可能导致孕畜早期流产[12]。本研究结果表明，利用大肠杆菌可诱导奶牛子宫内膜上皮细胞发生持续性炎症，添加约氏乳杆菌和CQN治疗后可显著改善炎症。

本试验首先添加了不同浓度的大肠杆菌对奶牛子宫内膜上皮细胞进行长时间的处理，发现106CFU/mL的大肠杆菌处理3 h后，细胞因子IL-6和IL-8的表达显著上升，且在24 h内持续上升，确定了奶牛子宫内膜上皮细胞炎症的持续发生。致炎处理后，单独添加乳杆菌和单独CQN处理细胞12 h后均显著降低了IL-6的释放，但是未降至正常水平，且对IL-8的释放无显著影响，这可能是由于持续性的炎症需要更长时间的治疗。Wang等[13]在添加植物乳杆菌处理炎症细胞时也观察到相似现象，于是将治疗时间延长后发现促炎因子的显著下调。然而，本试验发现约氏乳杆菌和CQN混合添加处理炎症细胞后，细胞因子IL-6、IL-8和IL-10均恢复至正常水平，这表明乳杆菌和CQN混合后大大提高了其抗炎效果。有研究表明，大肠杆菌依赖菌体表面黏蛋白黏附于细胞膜进行侵染[4]。因此，本研究对大肠杆菌和约氏乳杆菌的黏附细胞的状态进行了观察，发现约氏乳杆菌和CQN混合处理尽管没有显著降低大肠杆菌对细胞的黏附率，但是抑制了其生长，并且CQN的添加显著增强了约氏乳杆菌的黏附率，这可能是导致细胞炎症减缓的重要原因之一。Inturri等[14]研究发现，长双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌的联合使用可有效降低革兰氏阴性菌的黏附性能。大量研究表明，乳杆菌联合中药、维生素和一些糖类可以有效减缓炎症的发生并提高机体的免疫功能[15-17]。这些证据均表明，乳杆菌联合多种物质将会是高效治疗奶牛子宫内膜炎的新走向。尽管本研究发现约氏乳杆菌和壳聚糖季铵盐的混合处理可以有效抑制细胞因子的上升，但其是基于细胞层面的体外研究，且机制尚不明确，需要更深入的研究。