2019年滨州地区及周边规模化场牛支原体血清流行病学调查

李书光， 肖跃强， 程立坤， 赵家磊， 李来永， 刘吉山*

(1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600；2.青岛农业大学动物医学院，山东 青岛 266109；3.山东省滨州畜禽蜂胶疫苗研究开发推广中心，山东 滨州 256600；4.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；5.东营市河口区草原监理站，山东 东营 257200)

支原体是已知最小、最简单的能自我复制的原核微生物，普遍存在于自然界，是许多动物、植物及人类的病原体。目前支原体已接近200个种，其中有超过20种可感染牛。目前牛支原体病在世界上大部分的国家都有流行，是一种严重的、不可治愈的细菌性疾病，其病原为牛支原体，牛支原体在1961年在美国被首次分离到，能够感染所有日龄的牛，影响动物生产性能，并降低动物福利[1]；临床上以犊牛的肺炎、中耳炎、关节炎和奶牛的乳房炎为特征[2]，也有文献报道心内膜炎的发病[3]，呼吸道疾病是最严重和广泛的，导致了肉牛和奶牛的疫病爆发和重要经济损失[4]，并有一定的死亡率。应用LAMP和荧光定量PCR能够检测到奶样中牛支原体的病原[5]。

2019年对山东省滨州地区及周边部分规模化奶牛场肉牛场，使用ELISA方法对560份血清进行了牛支原体的血清学抗体检测，以期对规模化牛场的牛支原体感染情况有所了解，为牛支原体病的科学防控提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 血清样本的采集病料来源

2019年，对山东省滨州地区及周边部分规模化奶牛场和肉牛场的血清样本进行跟踪采样调查，选择7家规模化肉牛场(10～12月龄)和7家规模化奶牛场(24月龄)，采集血清样本560份，室温凝集后离心收集上清，4 ℃保存备用。

1.2 ELISA检测试剂盒

牛支原体间接Elisa试剂盒购自加拿大Biovet公司，批号：201012。

1.3 样品检测及分析

血清样品用稀释缓冲液做1∶100倍稀释，加入到事先包被好了的牛支原体抗原的微孔板上，经孵育，样品中的抗牛支原体抗体和包被好的支原体抗原发生结合；经几遍洗涤并去除未发生反应的物质，加入牛的酶标记抗体，经孵育，牛的酶标记抗体和样品中的抗体结合，形成抗原抗体和酶复合物；经第2次洗涤，去除未反应的酶标记物抗体，加入底物显色剂显色，加入终止液终止显色，用405 nm的单波长测定光密度值(OD值)，颜色的强弱表明检测样品中牛支原体抗体的含量。计算每个样品和对照的平均值，获得Radio(S/P)比值(Radio(S/P)=OD样品值/阳性对照OD值平均值)。Radio(S/P)≥0.4为阳性。

1.4 数据分析

根据检测数据的结果，使用SPSS 20软件进行统计学分析。

2 结果与分析

滨州地区及周边，规模化奶牛场(存栏1 000头以上)牛支原体血清的阳性率介于30%～100%之间，奶牛支原体血清阳性率为74.29%；规模化肉牛场(存栏1 000头以上)牛支原体血清的阳性率介于67.5%～100%之间，肉牛支原体血清阳性率为81.43%；滨州地区及周边牛的支原体血清阳性率为77.86%。使用SPSS 20软件统计分析(表1)显示，奶牛场1～5号场之间无统计学差异，6号场和7号场之间无统计学差异，6号场和7号场与1～5号场之间差异极显著(Fisher双尾精确检验P=0)；肉牛场8～12号场之间无统计学差异，13号场与14号场之间无统计学差异，13号场和14号场与8～11号场之间统计学差异极显著(Fisher双尾精确检验P=0)；奶牛群体牛支原体血清阳性率与肉牛群体相比，差异不显著(Fisher双尾精确检验P=5.3)。

表1 滨州地区及周边部分规模化牛场牛支原体血清学抗体阳性率及统计学分析

3 讨 论

牛支原体能够定植在健康牛的上呼吸道，是引发牛呼吸道疾病的重要病原之一[6]。牛支原体利用菌毛、表面可变脂蛋白、生物膜等能够侵入牛的免疫系统，牛支原体具有逃避中性粒细胞的特性[7]，宿主的免疫系统不能有效清除牛支原体的感染[8]，牛支原体感染后，免疫反应以TH2为主，产生的抗体类型以IgG1为主，并导致肺部炎症[8]。

牛支原体缺乏有效的疫苗，该病的控制主要是依赖于良好的生产管理配合病原抗体检测和有效的抗生素治疗进行控制，有时与呼吸道病毒或者巴氏杆菌混合感染，常增加临床及实验室的有效诊断和检测的难度。疫苗研制方面，活疫苗的应用前景更理想一些[9]，灭活疫苗在有些报道中有一定的效果，特别是使用皂素灭活的疫苗，免疫效果较为理想，但是目前为止亚单位疫苗方面没有突破性进展[10]。牛支原体具有导致免疫系统功能低下的特性[11]，在抗体阳性率较高的区域，应该加强对该疾病的关注，降低其对牛群的危害。细胞免疫对牛支原体的清除效果要比体液免疫更有效[12]。以皂素和溶菌酶二聚体作为佐剂制备全菌体灭活疫苗，能够有效激发牛支原体的机体细胞免疫[13]。史晓娜等成功利用家兔建立了牛支原体的感染模型，并证实灭活的牛支原体铝胶佐剂疫苗能够对家兔提供一定的保护，为疫苗回归本动物的研究提供了有力的数据支撑[14]。Zhang等发现了膜蛋白P81和UgpB的抗体具有介导补体杀灭活性，具有作为疫苗候选抗原的特性[15]。

牛支原体可在宿主体内长期存在，造成慢性感染，其对肉制品及奶制品行业的危害受到越来越多国家的关注。在美国，养殖场中牛支原体感染率最高可超过70%，每年对养牛业造成超过1.4亿美元的损失。在欧洲，25%～33%的牛肺炎与牛支原体有关[16]。在我国，由辛九庆等人从犊牛肺脏中首次分离得到牛支原体[17]，随后在国内多个省市均发现牛支原体感染病例。2017—2019年，本实验室接诊多起犊牛肺炎的病例，通过病原的分离鉴定和PCR检测方法确诊为牛支原体感染[18]，为山东省首次分离到牛支原体病原，开创了山东省研究牛支原体的先河。

定期对牛群进行抗体或者抗原的检测，结合鼻拭子病原的PCR检测和血清抗体的检测，杜绝支原体的传入，是一种防控牛支原体的方法[19]。犊牛支原体的抗体可能会受到母源抗体的影响，因此在采集样本时肉牛选择10～12月龄、奶牛选择24月龄左右的相对稳定的群体进行随机采样。本文中对山东省滨州地区及周边共14个规模化牛场进行了血清样本的采集，并进行了IgG抗体的ELISA检测。根据牛支原体血清ELISA检测结果可以看到，山东省滨州地区及周边规模化奶牛及肉牛场存在广泛的牛支原体感染。在数据分析上，可以看出肉牛的感染率略高于奶牛的感染率，但统计学上差异不显著。统计分析数据显示，不同的场区阳性率有差异，个别差异极显著，则不同的奶牛场和肉牛场，管理水平和硬件设施会影响支原体的感染率，管理水平较高、硬件设施较好、分区管理的场区，其阳性率较低；管理水平较低、硬件设施一般、混区饲养的场区，其阳性率较高。本实验室，使用实验室分离的牛支原体病原，培养自制牛支原体玻片凝集抗原，对140份血清进行了检测，总阳性率为63%，低于本文中使用的ELISA方法，而且两者的符合率极低，后续需要进一步对该本实验室的检测方法进行优化。

4 结 论

通过对滨州地区及周边的牛场的牛支原体血清流行病学调查，试验数据显示该区域存在不同程度的牛支原体感染，且有的牛场感染率极高，牛支原体感染可能成为危害国内规模化奶牛场奶牛健康的主要疫病之一，并存在垂直传播的风险，为了促进牛的健康养殖，有必要采取加强对牛支原体的流行病学调查和制订相应的综合防控方案的研究和推广。