不同方法对夏南牛口蹄疫免疫抗体水平检测的比对试验

2020-08-15石先华张成峰柏中锋孙秀玉王之保

中国牛业科学 2020年4期

石先华，张成峰，李静，柏中锋，孙秀玉，王之保*

(1.泌阳县动物疫病预防控制中心，河南泌阳 463700；2.泌阳县动物卫生监督所，河南泌阳 463700；3.泌阳县夏南牛研究推广中心，河南泌阳 463700)

长期以来“北繁南育”一直是我国肉牛养殖的主流模式，这种模式是造成我国肉牛疫病流行的主要原因之一，同时运输应激也为肉牛育肥企业带来了较大损失。近年来随着肉牛价格的持续攀升，肉牛育肥利润空间的增大，作为夏南牛主产区的河南省泌阳县，过去一些以饲养繁殖母牛为主的养殖场、特别是一些中小规模的养殖场户逐步向自繁自育转型。目前受饲养条件、饲养方式、从业人员文化素质、技术人才缺乏、管理水平等因素的影响，口蹄疫仍然是制约中小规模养殖场户发展的重要瓶颈之一。为探索中小规模养牛场自繁自育条件下，繁殖母牛、断奶犊牛口蹄疫适宜的免疫时间，检测口蹄疫免疫的效果，为中小规模养牛场制定科学的口蹄疫免疫程序提供参考数据，河南省肉牛产业技术体系泌阳综合试验站，在河南省现代农业产业技术体系专项经费支持下，开展了《不同方法对夏南牛口蹄疫免疫抗体水平检测的比对试验》。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验牛试验牛来自泌阳县羊册镇保才养牛场饲养的32头夏南牛繁殖母牛和12头断奶犊牛，繁殖母牛在免疫后30 d，60 d，90 d，120 d采集血样；断奶犊牛在免疫后10 d，40 d，70 d，100 d采集血样，疫苗为国家招标采购的口蹄疫O型灭活疫苗(OHM/02株)，每头牛2 mL，肌肉注射。

1.1.2 采血器材采血器材有采样箱、试管架、一次性离心管、5 mL注射器、酒精棉球、干棉球、记号笔、牛鼻钳或绳子、不干胶标签、签字笔、采样单、乳胶手套、一次性鞋帽、口罩、一次性防护服等。

1.1.3 检测试剂与设备口蹄疫O型抗体检测LB-ELISA试剂盒(新模式，生产批号：E190704，生产日期：20190724)，生产厂家为：洛阳莱普生信息科技有限公司；口蹄疫O型抗体检测固相竞争ELISA试剂盒(生产批号：20190726)生产厂家为：内蒙古金迈诗生物科技有限公司。检测仪器为美国伯腾全自动酶标仪，型号ELX-800。

1.2 方法

1.2.1 牛源准备对被选繁殖母牛、断奶犊牛注射天康生物股份有限公司生产的口蹄疫O型灭活疫苗(OHM/02株)每头牛2 mL，肌肉注射。

在繁殖母牛免疫后30 d，60 d，90 d，120 d，断奶犊牛免疫后10 d，40 d，70 d，100 d采血5 mL，检测口蹄疫抗体效价；当O型口蹄疫抗体效价<1∶64时，视为抗体水平不合格。查找原因，确定下次免疫时间。

1.2.2 血样制备母牛采用尾静脉采血，先将5 mL注射器针头换用9号针头备用，固定牛，使牛尾向上翘。在离尾根10 cm左右中点凹陷处，先用酒精棉球消毒，然后用换好的注射器垂直刺入约1 cm深，针头触及尾骨后退出1 mm进行抽血，每头牛不少于3 mL。采血结束，消毒并用棉球按压止血。

犊牛采用颈静脉采血：将断奶犊牛保定好，使其头部稍前伸，并稍偏向对侧，对颈静脉局部进行剪毛、消毒，看清颈静脉后，采血者用左手拇指或食指与中指，在采血部位稍下方，压迫静脉血管、使之充盈怒张。如果不剪毛时用手触摸，感觉圆滑、有弹性即是血管，另一手执5 mL注射器，与皮肤成45°角。由下方向上方用力刺入皮肤与血管内，见有血液流出后即可采集血样，每头牛不少于3 mL。采血结束，消毒并用棉球按压止血。

分离血清：将采集的牛全血倾斜45°角，放置室温静止1 h后，以4 000 r/min离心全血5 min，取上清液，并用记号笔对每份样品进行标记，待备用。

1.2.3 检测方法与判定标准一是采用液相阻断ELISA检测试剂盒(LB-ELISA)，对制备的牛血清样品进行O型口蹄疫抗体检测，试验操作及抗体效价判定。用液相阻断ELISA检测方法，对牛血清样品进行稀释度检测。根据抗体试剂盒说明书判定标准：抗体效价≥1∶128，判为阳性；抗体效价﹤1∶128，判为阴性；ELISA抗体效价与免疫动物攻毒保护关系：牛、羊抗体效价≥1∶128，99%以上保护；抗体效价在(1∶22)～(1∶90)之间，50%保护；抗体效价≤1∶16，不保护。二是采用固相竞争ELISA检测试剂盒，对制备相对应的牛血清样品进行O型口蹄疫抗体检测，试验操作及抗体效价判定，根据抗体试剂盒说明书的判定标准：若S/N值≥0.4，样品口蹄疫抗体为阳性，若S/N值<0.4，样品口蹄疫抗体为阴性，阳性判定为抗体合格、阴性判定为抗体不合格并与液相阻断ELISA检测结果进行比对。

2 结果与分析

2.1 繁殖母牛口蹄疫O型抗体检测

两种方法检测在繁殖母牛口蹄疫免疫抗体合格率时结果符合度不高。从表1可以看出，从检测的32头繁殖母牛血样中，采用液相阻断ELISA检测方法，在口蹄疫免疫后第60天，O型口蹄疫抗体合格率达87.5%，在免疫后120 d时抗体合格率达46.8%。抗体合格率没有达到100%；采用固相竞争ELISA检测方法，在口蹄疫免疫后第60，90天时抗体合格率均达到100%，在免疫后120 d抗体合格率达75%。

表1 繁殖母牛口蹄疫O型抗体检测结果分析

从图1可以看出，采用液相阻断ELISA检测方法抗体衰减时间早于固相竞争ELISA检测方法。两种检测方法出现抗体衰减变化规律不一致。

图1 繁殖母牛口蹄疫O型抗体衰减变化

2.2 断奶犊牛口蹄疫O型抗体检测结果

两种方法在检测犊牛口蹄疫免疫抗体合格率时表现出一定的一致性。从表2中看出，从检测的12头断奶犊牛血样中，采用液相阻断ELISA检测方法，在免疫后第40天时抗体合格率达100%，而在免疫后第100天，抗体合格率下降至41.6%，已是群体免疫不合格；采用固相竞争ELISA检测方法，在口蹄疫免疫后第40，70天时抗体合格率均达到100%，在免疫后100 d抗体合格率达75%。两种检测方法在犊牛免疫第40天时，抗体合格率均达到了100%。

表2 断奶犊牛口蹄疫O型抗体检测结果分析

从图2可以看出，采用液相阻断ELISA和固相竞争ELISA两种检测方法，在口蹄疫免疫后第40天时抗体合格率均达到100%检测结果一致；在第70，100天时，液相阻断ELISA检测方法抗体衰减时间早于固相竞争ELISA检测方法。

图2 断奶犊牛口蹄疫O型抗体衰减变化

3 结论

(1)在肉牛养殖生产中，检测牛口蹄疫免疫抗体水平时,液相阻断ELISA和固相竞争ELISA两种检测方法均可行。

(2)采用液相阻断ELISA试验结果显示：口蹄疫O型灭活疫苗抗体效价，繁殖母牛在免疫后30 d时免疫抗体合格率为65.6%，在免疫后60 d时抗体效价最高，免疫抗体合格率为87.5%，在免疫后90 d抗体效价开始下降，免疫抗体合格率为78.1%，在免疫后120 d时免疫抗体合格率为46.8%；断奶犊牛在免疫后10d时免疫抗体合格率为75%，在免疫后40 d时抗体效价最高，免疫抗体合格率为100%，在免疫后70 d抗体效价开始下降，免疫抗体合格率为83.3%，在免疫后100 d时免疫抗体合格率为41.6%。

(3)采用固相竞争ELISA试验结果显示：口蹄疫O型灭活疫苗抗体效价，繁殖母牛在免疫后30 d时免疫抗体合格率为78.1%，在免疫后60 d，90 d时免疫抗体合格率均为100%，在免疫后120 d时免疫抗体合格率为75%；断奶犊牛在免疫后10 d时免疫抗体合格率为83.3%，在免疫后40 d，70 d时免疫抗体合格率均为100%，在免疫后100 d时免疫抗体合格率为75%。