STC1诱导上皮-间质转化促进肺癌细胞的侵袭和迁移

魏丽荣，滕小艳，夏前林，杜玉珍,2

1.上海健康医学院附属第六人民医院东院检验科，上海 201306；2.上海市第六人民医院东院检验科，上海201306

肺癌是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，导致其高病死率的主要原因是局部复发和远处转移，但目前肿瘤细胞的具体转移机制仍未完全明确［1］。肺癌等恶性肿瘤的转移与上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的发生密切相关。斯钙素1（stanniocalcin 1，STC1）是一种激素类糖蛋白，以自分泌/旁分泌的方式产生效应。STC1的高表达与胃癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌等癌症的发展和不良预后相关［2-5］。在前期工作中我们发现，STC1蛋白在Ⅲ～Ⅳ期肺腺癌患者的血清和组织中显著升高，STC1过表达能够促进肺癌细胞增殖、抑制细胞凋亡；此外，我们还发现，肺癌患者组织中的STC1蛋白水平与肺癌临床分期、淋巴结转移个数呈正相关［6-7］。但STC1对肺癌细胞转移的影响及其作用机制，目前还未完全阐明。本研究通过检测STC1对肺癌细胞EMT标志物的影响，以及细胞侵袭和迁移能力的改变，探讨SCT1在肺癌细胞EMT及转移中的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

TRIzol试剂和LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；pBABE-puro反转录病毒载体、pUMVC和pCMV-VSV-G包装载体购自美国Addgene公司；胰蛋白酶消化液购自美国Solarbio公司；Transwell小室购自美国Corning公司；基质胶Matrigel购自美国BD公司；反转录试剂盒和蛋白预染Marker 购自加拿大Fermentas公司；实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）引物由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成；SYBR Green PCR试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒购自美国Thermo公司；RIPA组织细胞快速裂解液和30%丙烯酰胺（29∶1）购自美国Solarbio公司；聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）购自美国Millipore公司；鼠抗人STC1抗体（ab239518，1∶1000）购自英国Abcam公司，鼠抗人上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）（14472S，1∶1 000）、鼠抗人神经型钙黏蛋白（N-cadherin）（14215S，1∶1 000）、鼠抗人EpCAM（2929S，1∶1 000）、鼠抗人波形蛋白（vimentin）（49636S，1∶1 000）、兔抗人磷酸化细胞外调节蛋白激酶（phosphorylated extracellular signal-regulated protein kinase，p-ERK）1/2（4370S，1∶2 000）、鼠抗人ERK1/2（4696S，1∶2 000）、兔抗人E盒结合锌指蛋白1（zinc finger E-box-binding homeobox 1，ZEB1）（3396S，1∶1 000）、兔抗人β-连环蛋白（β-catenin）（8480T，1∶1 000）、鼠抗人锌指转录因子（Snail）（3895S，1∶1 000）和兔抗人β-actin（4970S，1∶1 000）抗体均购自美国CST公司，HRP标记羊抗鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）（ab6728，1∶8 000）、HRP标记羊抗兔IgG（ab6721，1∶10 000）；鼠抗E-cadherin（ab1416，1∶50）、兔抗vimentin（ab92547，1∶500）、羊抗兔IgG荧光二抗（ab150077，1∶800）和羊抗鼠IgG荧光二抗（ab150117，1∶800）均购自英国Abcam公司；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染料购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

使用实验室内已构建好的稳定过表达STC1的细胞系HLEC-STC1及其对照细胞系HLECEV，STC1沉默的A549细胞系A549-STC1 siRNA及对照细胞系A549-EV。细胞系的选择和构建过程详见本课题组前期已发表的文献［6］，采用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的DMEM培养基，于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养。

1.2.2 Transwell侵袭实验

将50 mg/L的Matrigel按1∶8比例稀释，包被transwell小室底部膜的上室面37 ℃ 30 min形成凝胶，使用前加入不含血清的DMEM培养基置于37 ℃温育1 h进行基底膜水化，吸弃培养基。将细胞稀释至2×105个/mL后接种200 μL细胞悬液到transwell小室中，24孔板下室中加入750 μL含10%FBS的DMEM培养液，每组设置3个重复孔。将孔板置于37 ℃培养箱中培养48 h，小心擦净上室未侵袭细胞及Matrigel，4%甲醛溶液固定，0.5%结晶紫染色后，于显微镜下随机选取3个不同的视野进行细胞计数，取平均值，以侵袭细胞数量反映侵袭能力。

1.2.3 细胞划痕实验

取对数生长期的细胞，以105个/mL的密度接种到6孔板中，待细胞覆盖率达到90%时，用移液器吸嘴均匀划痕，磷酸盐缓冲液（phosphatebuffered saline，PBS）冲洗划下的细胞后继续培养，在0、24、48 h观察并拍照记录。使用Image J软件测量细胞划痕面积，划痕愈合率=［1-（各时间点划痕面积/起始划痕面积）］×100%。愈合率越高表明细胞迁移能力越强。

1.2.4 RTFQ-PCR检测mRNA水平

TRIzol试剂提取细胞总RNA，根据反转录试剂盒说明书合成cDNA；以β-actin为内参基因，使用SYBR Green PCR试剂盒在ABI7500上进行RTFQ-PCR，扩增程序：95 ℃ 10 min，（95 ℃15 s，60 ℃ 45 s）×40，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。ZEB1上游引物序列：5’-GCTGTAAGTGCCATTTCTC-3’，ZEB1下游引物序列：5’-GTCCCAGTGTTTCAGTTTC-3’，产物长度159bp；E-cadherin上游引物序列：5’-GAGAACGCATTGCCACATACAC-3’，E-cadherin下游引物序列：5’-AAGAGCACCTTCCATGACAGAC-3’，产物长度164bp；N-cadherin上游引物序列：5’-CATCATCCTGCTTATCCTTG-3’，N-cadherin下游引物序列：5’-AAGTCATAGTCCTGGTCTTC-3’，产物长度165bp；Vimentin上游引物序列：5’-GCGTGAAATGGAAGAGAAC-3’，vimentin下游引物序列：5’-TGGAAGAGGCAGAGAAATC-3’，产物长度217bp；EpCAM上游引物序列：5’-GAAGGCTGAGATAAAGGAGATGGG-3’，EpCAM下游引物序列：5’-AGATGTCTTCGTCCCACGC-3’，产物长度135bp；Snail1上游引物序列：5’-TCGCTGCCAATGCTCATC-3’，Snail1下游引物序列：5’-CCTTTCCCACTGTCCTCATC-3’，产物长度134bp；β-actin上游引物序列：5’-CATCGTCCACCGCAAATGCTTC-3’，β-actin下游引物序列：5’-AACCGACTGCTGTCACCTTCAC-3’，产物长度201bp。

1.2.5 蛋白质印迹法（Western blot）检测蛋白表达水平

收集细胞，PBS洗涤后加入RIPA裂解液裂解细胞，BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，取约25 μg蛋白加入上样缓冲液，煮沸5 min变性，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）后，转膜至PVDF膜上。将膜浸泡在5%的脱脂奶粉中封闭1 h后，一抗4 ℃温育过夜。使用洗膜缓冲液（tris-buffered saline Tween，TBST）洗膜3次，加入HRP标记的二抗于37 ℃温育1 h后，再次用TBST洗膜3次，加入配制好的电化学发光（electrochemical luminescence，ECL）底物工作液后置于成像系统中采集信号图像，使用Image J软件进行分析。

1.2.6 细胞免疫荧光实验

细胞爬片用4%甲醛溶液固定30 min；PBS冲洗后滴加一抗，湿盒中4 ℃温育过夜；PBS冲洗后，加入荧光二抗湿盒室温温育1 h；防淬灭封片剂与DAPI 1∶500稀释封片后，使用荧光显微镜拍照分析。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 HLEC-STC1细胞系和A549-STC1 siRNA细胞系中STC1过表达和沉默效率验证

Western blot结果见图1，使用Image J软件分析，结果显示，HLEC-STC1中STC1水平显著高于其对照细胞系HLEC-EV和HLEC细胞，HLEC-STC1中STC1水平约为HLEC-EV的4.01倍（P＜0.05）。沉默的A549细胞系A549-STC1 siRNA中STC1水平显著低于对照细胞系A549-EV和A549细胞，较A549-EV下降约56.3%（P＜0.05）。

2.2 STC1促进肺癌细胞的侵袭和迁移

Transwell侵袭实验结果见图2，STC1过表达的HLEC-STC1细胞侵袭数量较空载体对照细胞HLEC-EV明显增加（473±17vs646±12，P＜0.05），STC1沉默的A549-STC1 siRNA细胞侵袭较空载体对照细胞A549-EV明显减少（702±11vs502±18，P＜0.05）。细胞划痕实验结果见图3，HLEC-STC1细胞划痕愈合率显著高于空载体对照细胞HLEC-EV［（38.4±1.9）%vs（18.4±6.8）%，P＜0.05］，A549-STC1 siRNA细胞划痕愈合率显著低于空载体对照细胞A549-EV［（7.8±4.2）%vs（41.4±4.7）%，P＜0.05］。

图1 Western blot实验检测HLEC、HLEC-EV、HLEC-STC1、A549、A549-EV和A549-STC1 siRNA细胞系中STC1蛋白表达水平Fig.1 Protein levels of STC1 in HLEC,HLEC-EV,HLEC-STC1,A549,A549-EV and A549-STC1 siRNA cell lines were examined by Western blot analysis

图2 Transwell实验检测HLEC-STC1和A549-STC1siRNA细胞系的侵袭能力Fig.2 STC1-overexpressed HLEC cells,STC1-silenced A549 cells and their respective control cells were examined by transwell invasion assay

图3 细胞划痕实验检测HLEC-STC1和A549-STC1siRNA细胞系的迁移能力Fig.3 The migration potentials of STC1-overexpressed HLEC cells,STC1-silenced A549 cells and their respective control cells were examined by wound healing assay

2.3 STC1促进肺癌细胞发生EMT

RTFQ-PCR检测结果见图4A，与空载体对照细胞相比，过表达STC1的HLEC-STC1细胞中上皮样细胞标志物E-cadherin表达水平下调，间质样细胞标志物N-cadherin和vimentin表达上调，EpCAM表达下调；STC1细胞沉默的A549-STC1 siRNA细胞中E-cadherin表达水平上调，N-cadherin、vimentin及EpCAM表达水平下调。Western blot结果见图4B，EMT相关基因的蛋白水平变化与RTFQ-PCR检测结果变化一致。进一步使用细胞免疫荧光技术检测A549-STC1 siRNA细胞及其对照细胞中EMT相关蛋白的变化，STC1沉默的肺癌细胞A549-STC1 siRNA中，E-cadherin含量升高，vimentin含量下降（图5），表明SCT1沉默抑制EMT过程。

图4 HLEC-STC1和A549-STC1 siRNA细胞及其对照细胞中EMT相关基因转录水平和蛋白水平的变化Fig.4 Relative expressions of EMT-related genes in STC1-overexpressed HLEC cells,STC1-silenced A549 cells and their respective control cells

图5 细胞免疫荧光检测A549-STC1siRNA细胞系及其对照细胞系中E-cadherin和vimentin的蛋白水平，使用DAPI进行核染Fig.5 E-cadherin and vimentin levels in STC1-silenced A549 cells and control A549 cells were analyzed by confocal microscopy,nuclei were stained with DAPI

2.4 STC1影响EMT相关信号转导通路和转录因子

RTFQ-PCR检测结果见图6A，HLEC-STC1中EMT相关转录因子Snail1和ZEB1的表达水平上调，A549-STC1 siRNA中Snail1和ZEB1的表达水平下调。Western blot结果见图6B，HLECSTC1细胞相较于HLEC-EV对照细胞，p-ERK1/2和β-catenin水平升高，同时EMT相关转录因子Snail1和ZEB1的表达水平也明显升高，而A549-STC1 siRNA中p-ERK1/2、β-catenin、Snail1和ZEB1的表达水平则明显下降。

图6 RTFQ-PCR及Western blot检测HLEC-STC1和A549-STC1 siRNA细胞系及其对照细胞系中p-ERK1/2、ERK1/2、β-catenin、ZEB1、Snail1及STC1的表达水平Fig.6 The mRNA and protein levels of p-ERK1/2,ERK1/2,β-catenin,ZEB1,Snail1 and STC1 were examined by RTFQ-PCR and Western blot in STC1-overexpressed HLEC cells,STC1-silenced A549 cells and their respective control cells

3 讨 论

转移是肺癌相关死亡的主要原因，EMT被认为在肿瘤转移中起关键作用［8-9］。肿瘤细胞的EMT信号激活可增强细胞侵袭、迁移和抗凋亡能力，改变肿瘤微环境，促进其转移至其他器官［10-11］。在EMT过程中，细胞中EMT相关的上皮标志物E-cadherin等表达水平降低，而间质标志物如N-cadherin和vimentin的表达水平上调，导致上皮细胞逐渐失去极性，细胞间的黏附连接被破坏，最终转化为具有间充质表型的细胞［12］。细胞发生EMT需要外源性或内源性的诱因，外源性的诱因包括吸烟、乏氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）、转化生长因子β（transforming growth factor-beta，TGF-β）等，内源性的诱因包括某些基因突变或过表达［13］。

STC1是一种旁分泌蛋白，其在癌组织中的表达高于癌旁组织，与肿瘤的生长和癌症转移有关［14-15］。本研究发现，STC1可促进肺癌细胞的侵袭和迁移；同时，STC1可抑制肺癌细胞E-cadherin等上皮标志物的表达，提高N-cadherin、vimentin等间质标志物的表达水平，提示STC1可以促进肺癌细胞发生EMT；此外，STC1还能够促进肿瘤干细胞标志物EpCAM地表达，已有研究［16-17］报道，肿瘤中EpCAM表达与vimentin和N-cadherin的表达呈正相关，还可通过破坏E-cadherin介导的细胞间黏附性下降，诱发EMT。因此，我们推测STC1可能是EMT的一种诱因，通过诱导EMT而促进肺癌细胞发生侵袭和迁移。

对于STC1如何作用于肺癌细胞诱导发生EMT，其内在机制目前尚未完全阐明。EMT是一个涉及许多信号通路和多种转录因子的动态复杂的过程［18-19］。本研究发现，STC1能够提高肺癌细胞中p-ERK1/2、β-catenin水平，促进EMT相关转录因子Snail1和ZEB1蛋白水平的升高；STC1水平的下调则抑制p-ERK1/2、β-catenin水平，并且Snail1和ZEB1蛋白水平下调。有研究［20］发现，肺癌骨转移过程中，Wnt/β-catenin信号通路激活，上调Snail1和ZEB1，下调E-cadherin，诱导EMT的发生。Chiu等［21］等研究发现，肺癌细胞A549中p-ERK1/2水平升高可上调ZEB1，而ZEB1又下调E-cadherin并上调纤连蛋白，诱导EMT的发生。据此，我们猜测STC1能够激活肺癌细胞的ERK和Wnt/β-catenin信号通路，上调转录因子Snail1和ZEB1的表达，而转录因子Snail1和ZEB1作为E-cadherin的重要阻遏蛋白直接抑制E-cadherin基因的表达，诱导vimentin基因的表达，从而促进EMT的发生。

综上，本研究初步阐明了STC1促进肺癌细胞EMT的分子机制。STC1可能通过激活ERK和Wnt/β-catenin信号通路，上调转录因子ZEB1和Snail1的表达水平，从而诱导EMT促进肺癌细胞的侵袭和迁移。