番石榴叶炮制品质量标准研究

莫单丹 周小雷 唐炳兰 周雅琴 孙国雄 谷筱玉*

1.广西药用植物园/广西药用资源保护与遗传改良重点实验室，广西 南宁 530023；2.广西药物不良反应监测中心，广西 南宁 530023

番石榴叶为桃金娘科植物番石榴PsidiumguajavaLinn.的叶。中医认为具有收敛止泻、消炎止血之功，用于久痢、泄泻、创伤出血、皮肤湿疹、瘙痒、热痱、牙痛。壮药认为具有调谷道、收敛止泻、止血的功效，用于阿意咪(痢疾)、啊肉甜(糖尿病)、能唅能累(湿疹)、诺嚎哒(牙周炎)。炒番石榴叶收敛止泻作用增强，用于单纯性消化不良泄泻,民间多用米炒番石榴叶治疗腹泻[1-4]。质量标准收载在《广西壮族自治区壮药药材质量标准》(二卷)中，其炮制项下只记载炒番石榴叶为加大米适量共炒至米变黄色，未规范炮制辅料的量及炮制品的质量标准，本课题组前期对番石榴叶炮制品制备工艺进行研究选出最佳炮制工艺，本实验在前期研究基础上，对番石榴叶炮制品进行显微特征、薄层色谱鉴别，并测定其水分、总灰分、酸不溶性灰分和浸出物的含量，采用HPLC对有效成分槲皮素[5-8]进行含量测定，为番石榴叶炮制品质量标准的制订提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器 数显恒温水浴锅(邦西仪器科技(上海)有限公司，型号：HH-6)；电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司，型号：FA2004)；电子分析天平(CP2250D，Sartorius)；1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；超纯水仪(美国Millipore Milli-Q Academic)；DZTW调温电热套(北京市永光明医疗仪器有限公司)；炒药机(山东青州市精诚医药装备制造有限公司，型号：CY-50)；LEICA生物显微(DM2000 LEICA/Germany)；硅胶G薄层板(青岛海洋化工有限公司)。

1.2 试药 番石榴叶采自广西平乐、靖西、平南等地，经广西药用资源保护与遗传改良重点实验室赵以民高级工程师、黄宝优高级工程师和宋志军副研究员鉴定为桃金娘科植物番石榴PsidiumguajavaLinn.的叶，共10批(见表1)。番石榴叶炮制品为将番石榴叶鲜品，除去杂质，按番石榴：粳米为3∶1的比例粳米置炒药机中共炒。在400 ℃条件下炒制20 min，粳米炒至焦黄色，取出，得番石榴叶炮制品饮片。实验中以番石榴叶(FSLY1)对应的制品(Z1)为对照药材。槲皮素对照品购自中国药品生物制品鉴定所，批号：100081-201610，甲醇、磷酸、乙腈均为色谱纯，乙醇、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇为分析纯。

表1 番石榴叶样品信息

2 方法与结果

2.1 显微特征 本品粉末棕黄色。淀粉粒单粒多见，椭圆形，直径4～8 μm，草酸钙簇晶直径35～40 μm，方晶、棕色块多见，直径8～20 μm。导管以螺纹导管为主，直径30～70 μm，石细胞数量较少，棕黄色。非腺毛随处可见，直径10～20 μm，表皮细胞呈多边形，气孔为平轴式，木栓细胞棕黄色。如图1所示。

1.淀粉粒 2.簇晶 3.方晶 4.气孔 5.导管 6.棕色块 7.木栓细胞 8.表皮细胞 9.纤维 10.非腺毛 11.石细胞图1 番石榴叶炮制品粉末显微特征图

2.2 薄层鉴别 取本品粉末2 g(粉末过2号筛)，置具塞锥形瓶中，加入95%乙醇50 mL ，超声处理30 min，过滤，滤液蒸干，残渣加水10 mL使溶解，以石油醚萃取2次，每次10 mL，合并石油醚提取液，蒸干，残渣加入甲醇2 mL溶解作为供试品溶液。另取番石榴叶炮制品对照药材2 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2015年版通则0502)试验，吸取对照药材、各批供试品溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇 (20∶10∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃电热板上加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，如图2所示。

注：1～3：对照药材(FSLY-Z1)4～12：样品 (FSLY-Z2～FSLY-Z12)图2 番石榴叶炮制品TLC

2.3 检查 将上述10批番石榴叶炮制品根据《中华人民共和国药典》[9]方法进行水分、总灰分、酸不溶性灰分及浸出物的检查。

2.3.1 水分 根据中国药典2015 年版第四部通则0832水分测定法项下烘干法进行测定。分别对上述10批药材进行水分测定，结果见表2。结果显示，10批番石榴叶炮制品水分测定结果为4.16%～10.1%。根据测定结果，考虑南方气候较潮湿，结合储藏过程中对水分控制的要求，暂定番石榴叶炮制品水分含量不得超过12%。

2.3.2 总灰分 根据中国药典2015 年版第四部通则2302 灰分测定法项下总灰分测定法进行测定。分别对上述批10制品进行总灰分测定，结果见表2。

结果显示，10批番石榴叶炮制品总灰分测定结果为5.12%～6.40%。根据测定结果，暂定番石榴叶炮制品总灰分含量不得超过7.0%。

2.3.3 酸不溶性灰分 根据中国药典2015年版第四部通则2302灰分测定法项下酸不溶性灰分测定法进行测定。分别对上述10批制品进行酸不溶性灰分测定，结果见表2。结果表明，10批番石榴叶酸不溶性灰分测定结果为 0.02%～0.20%。暂定番石榴叶炮制品酸不溶性灰分含量不得超过0.3%。

2.3.4 浸出物 以70%乙醇作溶剂，根据中国药典2015年版第四部通则 2201醇溶性浸出物测定法项下热浸法进行测定。分别对上述10批制品进行浸出物含量测定，结果见表2，结果表明，10批番石榴叶炮制品浸出物含量测定结果为26.21%～32.56%。根据测定结果，暂定番石榴叶炮制品药材浸出物含量不得少于26.0%。

表2 番石榴叶炮制品水分、灰分、浸出物及槲皮素含量 (n=3，%)

2.4 含量测定[10-13]

2.4.1 色谱条件 色谱柱为迪马C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.5磷酸的0.1三乙胺溶液(25∶75)；检测波长为372 nm ;流速为1.0 mL/ min;柱温为30 ℃；进样量为12 μL。葛根素的理论塔板数不低于5000。如图3所示。

2.4.2 对照品溶液的制备 取槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇制得每1 mL含槲皮素99 μg的溶液。

2.4.3 供试品溶液的制备 取番石榴叶炮制品粉末(过4号筛)1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇溶液80 mL,加热回流提取2 h，滤过，合并滤液，蒸干，残渣用色谱甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，用0.45 μm微孔滤膜过滤即得。

2.4.4 线性关系考察 取4.2项制得的对照品溶液，按上述色谱条件分别精密进样1、3、5、7、9、11 μL测定峰面积，以峰面积(Y)对进样量(X)进行线性回归。得回归方程为Y= 5799.3X+20.47,r=0.9999(n=6)。结果表明，槲皮素进样量在0.099～1.089 μg的范围内与峰面积线性关系良好。

注：A.槲皮素对照品的HPLC图； B.番石榴叶炮制品的HPLC图图3 番石榴叶炮制品的HPLC图

2.4.5 精密度试验 精密吸取取同一对照品溶液,按照上述色谱条件连续进样6次,记录色谱图。结果槲皮素峰面积的RSD为1.14%(n=6),表明仪器精密度良好。

2.4.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，按上述色谱条件分别于配制后 0、2、4、6、8、12 h进样测定，记录色谱图。以槲皮素峰面积计算，结果的RSD为1.23%(n=6)，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.4.7 重复性试验 取同一批样品粉末，按供试品溶液制备方法平行制备6份，依法测定,记录色谱图。结果的RSD为1.99%(n=6),表明方法有良好的重现性。

2.4.8 加样回收试验 取已知槲皮素含量的番石榴叶炮制品(FSLY-Z5)粉末0.5 g，精密称定，平行6份，分别精密加入与其含有等量的槲皮素对照品，按供试品制备方法制备供试液，按上述色谱条件测定槲皮素的含量，结果见表3。计算槲皮素平均回收率为98.61%，RSD为1.56%。表明方法的回收率良好。

表3 番石榴叶炮制品中槲皮素加样回收试验结果 (n=6)

2.4.9 样品含量测定 按照上述供试品溶液制备方法和色谱条件，对上述10批番石榴叶炮制品中的槲皮素进行含量测定。结果含量在0.056%～0.130%之间，平均含量为0.0625%。该制品中槲皮素的含量限度建议以干燥炮制品计不得少于0.05%。

3 讨论

实验分别取番石榴叶95%乙醇提取物、石油醚萃取物、三氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇等萃取物的溶液进行点样，以石油醚-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇不同比例为展开剂进行多次试验和筛选，发现取石油醚萃取物溶液点样，以石油醚：三氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇(20∶10∶1∶1)作为展开剂，斑点比较清晰，分离度较好，可用于番石榴叶炮制品的薄层鉴别分析。

在色谱条件的摸索当中，选择了甲醇-0.5%磷酸溶液、甲醇-0.5%磷酸的0.1%三乙胺溶液、乙腈-0.5%磷酸的0.2%三乙胺；乙腈-0.5%磷酸的0.1%三乙胺溶液等不同浓度作为流动相进行多次试验和筛选，结果发现乙腈-0.5%磷酸的0.1%三乙胺溶液(25∶75)为流动相，目标峰明显，对称因子好。同时考察了220～500 nm范围内槲皮素的吸收光谱，结果发现在372 nm处有强吸收峰，故选择372 nm为检测波长。

由于样品的采收、加工和贮藏等因素，番石榴叶炮制品各样品之间的水分、总灰分、浸出物和含量测定结果有一定的差异。根据测定结果，考虑南方气候较潮湿，结合储藏过程中对水分控制的要求，建议番石榴叶炮制品药材水分、总灰分及酸不溶性灰分分别不得过12%、7%、0.3%，醇溶性浸出物应不少于26.0%，已有研究[5]表明番石榴叶苷类部位的止泻作用与其槲皮素苷类含量呈相关性,其药效受槲皮素苷类的含量变化影响,本研究选择槲皮素含量作为质量控制指标，番石榴叶炮制品中的槲皮素进行含量测定结果在0.056%～0.130%之间，含量平均为0.0625%。根据样品含量检测结果，考虑炮制品原料药产地、炮制加工等因素的影响，暂按含量平均值的80%拟定番石榴叶炮制品中槲皮素的含量应不少于0.05%

4 结论

本实验描述了番石榴叶炮制品的显微特征，并研究了其薄层鉴别方法，制定了番石榴叶炮制品水分、总灰分、酸不溶性灰分及醇溶性浸出物限度，建立了番石榴叶炮制品中槲皮素的含量测定方法并进行验证，暂定番石榴叶炮制品药材水分、总灰分及酸不溶性灰分分别不得过12%、7%、0.3%，醇溶性浸出物应不少于26.0%；番石榴叶炮制品中槲皮素的含量应不少于0.05%。本研究所建立的方法准确可靠，为番石榴叶炮制品的质量评估、监管等提供科学依据。