生姜漱口水抗菌活性的研究

朱婷婷 李宏俊 何雨 崔文丽 马伟 沈悦(亳州学院，安徽 亳州 236800)

0 引言

生姜(Zingiber officinale Roscoe)又名地辛、百辣云，属姜科姜属多年生草本植物，药食两用。它既是一种调味料，也是一味常见的中药材。经典药学著作研究表明，它具有解表散寒、温中止呕、化痰止咳、解鱼蟹毒之功效，被誉为“呕家圣药”。生姜油(Ginger oil)为生姜的提取物，在医药行业得到了广泛的应用，尤其是在保健及疾病的预防和治疗方面，如抗衰老、抑菌、溶栓、降血脂、抗肿瘤等[1]，有明显的功效。

近年来，口腔疾病愈发引起医学界的关注，口腔“炎症”问题为重中之重，而炎症的有效控制在于提高机体抵抗力和降低微生物数量[2-4]，最平常的刷牙并不能完全清楚炎症，且市面上大多数牙膏都以美白牙齿和改善口气为主，并不能完全清楚这些炎症。功能性的漱口水作为一种补充方法，具有良好的渗透性，可深入口腔各部位，包括牙刷难接触的牙龈边缘和牙缝间，从而起到有效的抑菌作用，改善口腔健康[3-4]

本研究以生姜油为原料，添加柠檬酸、山梨醇、木糖醇等开发成一种新型漱口水，并具有很好的清洁口腔和抑菌作用，为其未来产业化生产提供了技术支持。

1 材料

1.1 仪器

XSE104电子天平(梅特勒-托利多 METTLER TOLEDO)、超纯水器(科宁特 Cleaned)、SW-CJ-1F/1FD单人单面垂直送风净化工作台(苏州净化)、PWT-P75B恒温培养箱(达斯卡特)、GR85DA灭菌容器(致微仪器有限公司)、DW-86L338J(2018)超低温保存箱(青岛海尔生物医疗股份有限公司)。

1.2 药品与试剂

氯化十六烷基吡啶鎓(萨恩化学技术有限公司)、吐温-20(天津市科密欧化学试剂有限公司)、柠檬酸(AR，上海展云化工有限公司)、山梨醇(食品级，浙江一诺生物科技有限公司)、木糖醇(食品级，河南万邦实业有限公司)、糖精钠(食品级，河南万邦实业有限公司)桂花香精(食品级，河南万邦实业有限公司)、庆大霉素(医用)、生理盐水(医用)、胰酪大豆胨液体培养基(TSB，北京三药科技开发公司)、胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA，北京三药科技开发公司)。

1.3 标准菌株

金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus ATCC25923)、大肠杆菌 (Escherichia coli ATCC25922)。

2 方法

2.1 生姜漱口水的配制

精密称取生姜油0.25g，加吐温2.5g，充分晃动混匀，缓慢加入500mL 60℃的纯净水，充分搅拌至澄清透明。再加入吡啶鎓2.5g，柠檬酸2.5g，山梨醇10g，木糖醇10g，糖精香精若干，充分搅拌混匀，放置3h。待溶液冷却至室温，取最上层250mL，灌装、灭菌、贴标签，即得生姜漱口水。

2.2 生姜漱口水抗菌活性测试

2.2.1 菌种的活化及培养

将高压灭菌后的液体培养基(10mL)注入离心管中冷却至室温；从-80℃的保存箱里拿出菌种放置至室温；再在超净工作台上用接种环蘸取菌液放入离心管中(重复2～3次)，每种菌株做三组平行实验，放在37℃恒温培养箱中，培养24h。

2.2.2 菌种的纯化培养

用接种环蘸取2.2.1所述，培养24h后略微浑浊的菌液以平板划线法在培养基上接种，每个菌种接种三组，结束后倒置放入恒温培养箱培养24h。用接种环挑取平板上独立的单个菌落，放入装有液体培养基的离心管中，每种菌株做三组平行实验，在37℃下培养24h。

2.2.3 细菌总菌落数的测定

分别取上述2.2.2纯化后的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌液1mL制成不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于无菌平皿中与营养琼脂培养基混合，每个浓度做三组平行实验，结束后倒置于37℃的恒温培养箱培养48h。挑选每平皿平均细菌菌落数大于30，小于300的平板计算原始菌液的浓度(CFU·mL-1)

2.2.4 菌悬液的制备

取上述已知浓度的原菌液，加生理盐水，配置成含菌数约为0.5麦氏浓度(1×108CFU·mL-1)的菌悬液，4℃下储存备用。

2.2.5 抗菌活性测试

纸片扩散法[5-6]用已灭菌的移液枪吸取100μL菌悬液于TSA培养基表面，用无菌三角涂布棒涂布均匀；分别取生姜漱口水、庆大霉素、生理盐水各8μL滴于6mm无菌滤纸片上，充分吸收；将含漱口水的滤纸片贴到平板中，并放入含有庆大霉素的滤纸片作为阳性对照和含有无菌生理盐水的滤纸片作为阴性对照，每种菌株做三组平行实验。于37℃培养箱培养24h后，采用十字交叉法量取抑菌圈直径(mm)，实验结果以x±s表示。

2.2.6 最小抑菌浓度(MIC)的测定

采用微量肉汤稀释法[7-9]测定。取一次性无菌96孔板，在第一排每个孔中分别加入100μL TSB培养基。取100μL漱口水加入到第一孔，混匀后吸取100μL加入第二孔，反复二倍稀释至第10孔，第10孔吸取100μL弃去。再吸取1×108CFU·mL-1加入到1至11孔，充分混匀后加盖置于37℃恒温培养箱中培养24h。取出，用酶标仪测其吸光度。每种菌株做三组平行实验。

上述1～10孔为实验组；第11孔只加培养基和菌液作为阳性对照组，用以观察该浓度的菌液是否生长良好并用于实验；第12孔只加培养基作为阴性对照组，用以观察培养基是否被污染。用酶标仪测量实验组和对照组的吸光度，并计算其MIC。

2.2.7 最低杀菌浓度(MBC)的测定

采用琼脂培养基平板法[10]进行测定。用移液枪从上述2.2.6的96孔板中未见细菌生长的孔里吸取100μL培养液，接种至TSA培养基中，用无菌三角涂布棒涂布均匀，倒置于37℃恒温培养箱中培养24h。每种菌株做三组平行实验。

3 结果与讨论

3.1 细菌总菌落数

计算公式：

式中：C为某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V为涂布平板时所用的稀释液体积(mL)；M为稀释倍数。实验数据详见表1。

金黄色葡萄球菌浓度：1.02×1011CFU·mL-1；

大肠杆菌浓度：7.7×1010CFU·mL-1。

表1 细菌菌落数

3.2 抑菌圈

本实验以抑菌圈大小评价抑菌效果，抑菌圈越大，表示抑菌效果越好，详见图1。生姜漱口水对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有不错的抑菌效果，且抑菌效果稳定，二者抑菌圈直径均>10mm，见表2。

3.3 漱口水MIC和MBC的测定

金黄色葡萄球菌96孔板的吸光度数据详见图2，大肠杆菌96孔板吸光度数据详见图3。MIC为生姜漱口水对两个菌种的平均抑制浓度，MBC为两菌种每平皿细菌菌落数小于5对应的 漱口水浓度的平均数，详见表3。

图1 不同菌株抑菌圈大小结果

表2 生姜漱口水的抑菌活性(x±s,n=3)

图2 金黄色葡萄球菌96孔板吸光度数据

图3 大肠杆菌96孔板吸光度数据

表3 生姜漱口水的MIC和MBC测定结果(n=2)

4 结语

通过一系列抗菌测试，发现生姜漱口水对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用都十分显著，二者MIC都为0.49mg/mL；MBC分别为1.95mg/mL和0.98mg/mL。该漱口水对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用比抗生素更加温和且安全，不仅能清洁口腔和改善异味，还可以抑制细菌滋生，是一款安全高效的功能性漱口水。本研究丰富了现有口腔护理产品的功能和种类，同时还为生姜漱口水后续研发和生产提供了理论参考。