阿司匹林通过调节CTRP6 抑制糖尿病大鼠心肌纤维化和炎症反应

厉歆然,刘建军,蒋 磊

(安徽省第二人民医院 药学部,合肥 230061)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是威胁人类健康最常见、最重要且无法根治的慢性代谢性疾病之一。 随着人们生活水准提高,饮食结构改变及老龄化严重,糖尿病发病率明显增加[1]。 糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是由糖尿病引发,独立于冠状动脉疾病或高血压的心脏疾病,是糖尿病患者心力衰竭高患病率及高致死率的主要原因之一。 心肌间质重构及纤维化是DCM 的特征性病理表现。 近期研究亦发现炎症反应与DCM 密切相关[2-3]。 因此,深入研究糖尿病心肌纤维化、炎症反应与DCM 的关系及其分子作用机制尤为重要。

C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白6(C1/qtumor necrosis factor-related protein 6,CTRP6)是新进发现的一类脂肪因子蛋白超家族成员之一[4-5]。 其广泛表达于人体组织器官(胎盘、心脏、肾等),参与包括心血管疾病、糖尿病和肥胖症等疾病发生发展[6]。既往研究表明,CTRP6 参与多种病理状态下组织和器官炎症反应以及纤维化的发生与发展[7]。 在大鼠心肌梗死模型中,CTRP6 表达显著降低,过表达CTRP6 可以改善大鼠心肌梗死后新功能障碍和心室重构[8]。 但是有关CTRP6 在糖尿病心肌纤维化和炎症反应中的作用尚不清楚。 本研究建立糖尿病心肌病大鼠模型,观察给予阿司匹林药物干预后大鼠心肌组织纤维化状况,炎症反应以及CTRP6 蛋白表达变化,探究其对糖尿病心肌病的保护作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF 级,6 ～8 周,雄性,SD 大鼠30 只,体重为180～200 g,由安徽医科大学动物试验中心提供[SCXK(皖)2017-001],实验在安徽医科大学[SYXK(皖)2017-004]进行。 本实验方案通过安徽医科大学动物伦理委员会审核批准(20170625004),实验按照3R 原则给予相关人道关怀。

1.2 主要试剂与仪器

链脲佐菌素和CTRP6 抗体均购自于美国Cell Signaling Technology 公司；Tubulin 抗体购自于武汉博士德公司；RT-PCR 试剂盒购自TaKaRa 生物公司；CTRP6 引物设计由上海生工生物工程公司完成；实验使用二抗购自于武汉博士德公司；一抗稀释液、二抗稀释液购自于江苏碧云天公司；实验所需耗材购自于北京中杉金桥生物技术公司。

组织匀浆仪:武汉维塞尔生物科技有限公司；-80℃超低温冰箱:青岛海尔集团；低温冰箱:合肥美菱股份有限公司；多功能酶标仪:Thermo 赛默飞世尔；高速台式冷冻离心机:湖南湘仪实验室仪器有限公司； 荧光倒置显微镜: 日本/奥林巴斯Olympus；PCR 仪器:Bio-Rad 伯乐；Western blot 检测装置:美国Bio-Rad 伯乐公司；高纯水机:美国Millipore 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物处理与分组

选取健康雄性SD 大鼠,体重180 ～200 g,适应性喂养一周后随机分为三组每组各10 只,糖尿病组和阿司匹林组大鼠腹腔内注射STZ(60 mg/kg)构建DM 模型,对照组大鼠给予等容积生理盐水腹腔注射。 对于血糖值连续3 d 均高于16.7 mmol/L 大鼠视为DM 造模成功。 第4 天起,阿司匹林处理组给予生理盐水溶解的阿司匹林1 mg/(kg·d)灌胃,正常对照组和糖尿病组大鼠给予等体积的生理盐水灌胃。 模型建立成功10 周后检测大鼠体重、血糖、血脂、空腹胰岛素等。

1.3.2 超声心动图检测

将大鼠麻醉,前胸部皮肤用脱毛膏备皮,仰卧位。 采用Vevo 770 动物高分辨率超声成像系统评价实验大鼠的心脏结构及功能。 选用RMB 716 大鼠高频探头,在二维影像指导下,用M 超在左室长轴切面测量IVSd:舒张末期室间隔厚度；IVSs:收缩末期室间隔厚度；LVIDd:舒张末期左室内径；LVIDs:收缩末期左室内径；LVPWd:舒张末期左室后壁厚度；LVPWs:收缩末期左室后壁厚度；并计算左室射血分数LVEF 及左室短轴缩短率(FS)=(LVIDd-LVIDs)/LVIDd,根据EF 与FS 评价左室收缩功能。 把取样容积置于二尖瓣前叶瓣环处记录组织多普勒图像,测量舒张早期二尖瓣半环速度峰值(E′)和舒张晚期二尖瓣半环速度峰值(A′),计算E′/A′,根据舒张期二尖瓣E 峰、A 峰速度及E′/A′比值来评价大鼠左心室舒张功能。 所有测量均由同一操作者完成,连续测定5 个心动周期,取其平均值。

1.3.3 心肌组织形态学观察

心肌组织4%多聚甲醛固定,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋、切片,行Masson 染色观察大鼠心肌形态、间质胶原和心肌纤维化情况。

1.3.4 酶联免疫吸附测定(ELSIA)

按照中杉金桥生物有限公司大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α 检测试剂盒说明书进行含量测定。 具体步骤如下:

1)标准品加样:96 孔酶标包被板,每孔加入50 μL 不同浓度的标准品溶液；

2)待测品加样:将待测样品稀释5 倍后加入酶标板内,轻轻摇晃并混匀；

3)加酶:每孔加入100 μL 酶试剂；

4)孵育:封板膜封板后,置于37℃恒温烘箱内孵育1 h；

5)稀释液配置:使用去离子水稀释20×的浓缩液为1×备用；

6)洗涤酶标板:揭去封板膜,倾去液体,并加入洗涤液清洗,重复3～5 次,甩干；

7)显色:每孔加入A:B=1 ∶1 (50 μL:50 μL),轻摇混匀后,避光置于37℃恒温烘箱内孵育15 min；

8)终止反应:每孔加入50 μL 终止液,终止显色反应；

9)吸光度测定:单功能酶标仪450 nm 处测定各孔吸光度值。

1.3.5 实时荧光定量PCR

利用TRIzol 提取各组大鼠心肌组织总mRNA,将总的mRNA 逆转录成cDNA,按照说明书进行PCR 扩增。 PCR 引物设计如表1。

1.3.6 Western blot

1)取出大鼠的心肌,剪碎后放置于1.5 mL 的组织研磨管内并按照1 ∶2 ～1 ∶3比例加入组织裂解液放置在已经预冷后的组织匀浆仪中进行研磨；2)实验样本放置于4℃转速设置为12000 r/min的高速离心机内,离心15 min,收集组织上清液,并进行蛋白质浓度测定；3)蛋白质凝胶电泳,湿转转膜,孵育CTRP6 和Tubulin 抗体(1 ∶1000)4℃过夜,孵育山羊抗小鼠和山羊抗兔二抗(1 ∶5000)室温1 h；4)洗膜,滴加适量的显影液,显影并拍照。CTRP6 蛋白表达量通过Image J 软件分析灰度值得到相对表达。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件进行数据统计分析,数据采用平均数±标准差()表示,采用ANOVA 分析方法用于多组之间比较,采用t 检验方法用于两组间差异的比较,统计数据的结果以P＜0.05 被为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 阿司匹林对糖尿病大鼠心功能的影响

超声心动图常用于无创评价心功能,各组大鼠饲养10 周后进行大鼠超声心动图检测。 在小动物超声影像学的指引下,对大鼠IVSd、 IVSs、LVPWd 及LVPWs 相关参数进行测量,并计算得出EF 和FS。 通过EF 和FS 评价大鼠左心室收缩功能；同时检测各组大鼠舒张期二尖瓣血流E峰、A 峰,并计算E/A 比值评价大鼠左心室舒张功能。 结果显示,与Control 组相比,DM 组大鼠IVSd、 IVSs、LVPWd 及LVPWs 均 显 著 升 高(P ＜0.05,P＜0.01),EF,FS 和E/A 水平显著降低(P＜0.05,P＜0.01)；与DM 组相比,Aspirin 药物干预 组 可 以 显 著 降 低 IVSd、 IVSs、 LVPWd 及LVPWs 参数指标,改善EF,FS 和E/A 水平。 以上结果表明Aspirin 可以改善糖尿病大鼠心肌结构损伤和功能异常(见表2)。

表1 CTRP6 和Tubulin 上下游引物序列Table 1 CTRP6 and Tubulin forward primer and reverse primer sequences

2.2 阿司匹林对糖尿病大鼠心肌纤维化的影响

为探究Aspirin 对糖尿病大鼠心肌纤维化的影响,本研究通过Masson 染色观察各组大鼠心肌纤维化状况。 结果发现,糖尿病大鼠心肌间质和心肌微血管周围胶原沉积增多、纤维化发生情况显著,给予Aspirin 药物干预后可显著降低糖尿病大鼠心肌纤维化状况,改善心肌结构与功能(见图1)。

2.3 阿司匹林对糖尿病大鼠炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的影响

为探究阿司匹林对大鼠心肌炎症的影响,本研究通过ELSIA 检测各组大鼠心肌组织匀浆后炎症细胞因子含量。 结果显示,DM 组IL-β、IL-6、TNF-α含量显著增加(P＜0.01)；给予阿司匹林药物干预后可显著降低IL-β、IL-6、TNF-α 含量(P ＜0.05,P ＜0.01)(见表3)。

2.4 阿司匹林对CTRP6 蛋白表达的影响

为探究阿司匹林对糖尿病心肌纤维化和炎症反应的机制影响,本研究通过RT-PCR 和Western blot 检测抗炎蛋白CTRP6 的表达水平。 结果显示,与Control 组相比,DM 组大鼠心肌组织CTRP6 表达显著降低(P＜0.05,P＜0.01)；相比与DM 组,Aspirin处理组可显著上调CTRP6 蛋白表达(P＜0.05,P＜0.01)(见图2A、图2B)。

表2 各组大鼠左心室功能超声心动图参数( )Table 2 Left ventricular function echocardiographic parameters of rats in each group

表2 各组大鼠左心室功能超声心动图参数( )Table 2 Left ventricular function echocardiographic parameters of rats in each group

注:与对照组相比, **P＜0.01；与糖尿病组相比,#P＜0.05,##P＜0.01。Note.Compared with the Control group, **P＜0.01.Compared with the DM group, #P＜0.05, ##P＜0.01.

参数Parameters对照组Control糖尿病组DM阿司匹林组Aspirin IVSd (mm) 1.52±0.06 1.88±0.07** 1.63±0.05##IVSs (mm) 1.93±0.09 2.72±0.10** 2.34±0.11##LVIDd (mm) 6.81±0.12 8.02±0.09** 7.87±0.12#LVIDs (mm) 4.14±0.19 5.76±0.06** 5.28±0.19##LVPWd (mm) 1.07±0.08 1.96±0.11** 1.67±0.09##LVPWs (mm) 1.54±0.08 2.50±0.16** 2.25±0.20#EF (%) 73.79±1.78 67.54±1.75** 70.29±2.03#FS (%) 40.20±2.31 30.29±3.01** 34.48±2.95#E/A 1.62±0.23 1.32±0.07** 1.50±0.09##

图1 各组大鼠心肌纤维化状况Figure 1 Myocardial fibrosis status of rats in each group

3 讨论

糖尿病为慢性代谢性疾病,易产生多种并发症,其中心血管并发症约占糖尿病患者死亡率的65%。 糖尿病心肌病是一种独立于高血压和冠心病的心肌结构和功能变化的病理亚群,主要表现为心肌纤维化和心肌肥厚。 心肌纤维化是指心脏中胶原蛋白的过多生成、沉积,最终导致瘢痕组织过度增生的一种心脏病理性改变[9-10]。 研究证实,心肌受损时会诱发心肌细胞的凋亡、坏死、焦亡等进而激活肌成纤维细胞,启动组织修复。 异常的病理条件下,诱导因子会持续性的激活肌成纤维细胞,导致心肌纤维化的发生[11]。 糖尿病心肌纤维化是糖尿病心肌病发生的一个重要原因,但是有关纤维化的药物治疗尚不完全明确。 因此,通过有效药物干预抑制心肌纤维化过程对糖尿病心肌病的治疗至关重要。

Aspirin 为一种经典的解热镇痛、非甾体抗炎药、抗血小板聚集药。 研究发现Aspirin 可以改善糖尿病合并的大血管和微血管病变,降低细胞炎症反应[12]；Aspirin 可通过抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)胶原合成以及活性氧的产生以及抑制IL-18 诱导的CFs 增殖,改善心肌细胞功能[13-14]。 以上研究共同表明Aspirin可能发挥潜在的抗心肌纤维化以及炎症作用。 但是有关Aspirin 与糖尿病心肌病心肌纤维化的关系未有报道。 为此,本研究通过Aspirin 1 mg/(kg·d)大鼠灌胃处理10 周,观察大鼠心脏功能变化以及心肌纤维化状况。 结果显示,相比与Control 组,DM 组大鼠IVSd、 IVSs、LVPWd 及LVPWs 均显著升高,EF,FS 和E/A 水平显著降低,表明糖尿病大鼠心脏结构和功能出现严重损伤；给予Aspirin 后可以改善糖尿病大鼠心脏结构损伤和功能异常。 Masson 染色发现,DM 组大鼠心肌间质和血管周围胶原沉积增多,Aspirin 组大鼠心肌胶原沉积显著减少。 炎症在DCM 发生发展中同样扮演重要作用。 既往研究发现在糖尿病大鼠心肌组织和血浆中炎症细胞因子IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α 等显著升高[15]。 体外细胞实验:IL-1β 处理新生大鼠心肌细胞导致其收缩功能异常,脂质过氧化和蛋白质氧化增加,通过抑制IL-1β 可以降低上述效应[16]。 本研究通过ELSIA 检测各组大鼠心肌组织炎症细胞因子水平,结果发现,与Control 组相比,DM 组大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α 含量显著增加,给予Aspirin 干预后可降低上述炎症因子释放。 以上结果共同表明Aspirin 可通过降低糖尿病大鼠心肌纤维化状况抑制炎症反应,改善心肌结构与功能。

表3 各组大鼠IL-β、IL-6、TNF-α 水平比较( )Table 3 Comparison of IL-β, IL-6 and TNF-α levels of rats in each group

表3 各组大鼠IL-β、IL-6、TNF-α 水平比较( )Table 3 Comparison of IL-β, IL-6 and TNF-α levels of rats in each group

注:与对照组相比,**P＜0.01；与糖尿病组相比,#P＜0.05,##P＜0.01。Note.Compared with the Control group, **P＜0.01.Compared with the DM group, #P＜0.05, ##P＜0.01.

组别Groups IL-1β(ng/L) IL-6(ng/L) TNF-α(ng/L)对照组Control group 41.4±21.8 23.1±7.2 300.5±28.8糖尿病组DM group 97.5±19.1** 50.2±7.0** 877.3±40.9**阿司匹林组Aspirin group 68.9±10.1## 39.9±8.4# 687.3±21.5##

图2 各组大鼠心肌组织CTRP6 表达变化Note.Compared with the Control group, **P＜0.01.Compared with the DM group, #P＜0.05, ##P＜0.01.Figure 2 Changes of CTRP6 expression in rat myocardium

CTRP6 参与多种组织炎症反应与纤维化过程。在庆大霉素诱导的大鼠急性肾损伤模型中血清CTRP6 含量显著降低,注射CTRP6 腺病毒载体可以降低大鼠血清中尿素氮和血清肌酐含量,进一步研究CTRP6 干预可以显著降低大鼠肾组织中IL-1β和TNF-α 含 量[17-18]。 在 大 鼠 心 肌 梗 死 模 型 中CTRP6 表达显著降低,外源性过表达CTRP6 可以抑制TGF-β1 诱导肌成纤维细胞转化[19]。 但是有关CTRP6 与糖尿病心肌纤维化和炎症反应的关系尚不清晰。 在本研究中我们通过RT-PCR 和Western blot 检测大鼠心组织CTRP6 表达变化。 结果发现DM 组心肌组织CTRP6 mRNA 和蛋白表达均显著降低,给予Aspirin 药物干预后可以抑制CTRP6 表达的下调,改善糖尿病心肌纤维化与炎症反应。

综上所述,本研究通过探究Aspirin 对糖尿病大鼠心肌纤维化和炎症反应的影响及其分子作用机制。 结果发现Aspirin 可以促进CTRP6 表达抑制糖尿病心肌纤维化和炎症反应进而改善心肌结构与功能。 以上研究结果为Aspirin 用于治疗糖尿病心肌纤维化和炎症反应提供了理论依据。