bFGF 及PDGF 联合应用对大鼠胫骨骨折愈合的影响

童九辉,王 斌,袁 鹤,张 华,宋永周,马 维

(河北医科大学第二医院骨科,石家庄 050000)

骨折不愈合是骨科医生共同面对的问题。Mills[1]通过研究发现苏格兰地区大约有超过千人的患者存在不同程度的骨折延迟愈合或不愈合,在整个英国这个数据可以达到11700 人。 促进骨折愈合的因素有很多,Morley 等[2]及刘继超等[3]发现脑外伤合并骨折时碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)以及血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor ,PDGF)的表达水平增高等。 郭志豪等[4]和唐彦峰等[5]也分别通过骨折周围局部应用bFGF、PDGF 证实其可以加速骨折愈合。 大量实验已经证明单独应用bFGF 或PDGF 可以加速骨折愈合,但对其可能的作用机制并未阐述清楚。 本实验旨在通过联合应用bFGF、PDGF,来了解其对大鼠骨折愈合过程的影响,研究其作用机制,也为药物未来能促进骨折愈合的临床应用提供研究基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

48 只成熟雄性清洁级SD 大鼠,约8 周龄,体重在210 ～230 g,购自河北省实验动物中心[SCXK(冀)2018-004],无菌实验操作于河北医科大学第二医院动物实验室进行[SYXK(冀)2016-003],已通过河北医科大学第二医院科研伦理委员会的批准(2019-P019),并遵照实验动物使用的3R 原则对实验动物提供人道关怀。

1.2 主要试剂与仪器

碱性成纤维细胞生长因子(厂家:武汉华美,货号:CSB-YP008625RB)；血小板衍生生长因子(厂家:武汉华美,货号:CSB-YP017708RA)；抗体点样保护液(北京博奥生物,货号:440015)；牛血清白蛋白(BIOFROXX 公司)；bFGF 抗体(厂家:北京博奥森,货号:bs-0217R)；PDGF 抗体(厂家:北京博奥森,货号:bs-10073R)；补体C3 抗体(厂家:北京博奥森,货号:bs-2934R)；PBST 洗片缓冲液(河北博海生物自配)；Streptavidin-CY3(厂家:艾美捷科技公司货号:7100-12)；抗体标记脱盐柱(厂家:pierce 公司,货号:43230)；Bio MixerⅡ三维旋转杂交仪(北京博奥生物)；Smart Arrayer 微阵列芯片点样系统(北京博奥生物)；Slide Washer 8 洗片仪(北京博奥生物)。

PBST 洗片缓冲液(1 L)配方:氯化钠8.0 g,磷酸氢二钠2.9 g,氯化钠8.0 g,氯化钾0.2 g,磷酸二氢钾0.2 g,1L 的ddH2O 溶解,加入0.5%的吐温20。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组

所有动物利用随机数字表法将其分成4 组(A(bFGF 组),B(PDGF 组),C(bFGF+PDGF 联 合组),D 组(空白对照组))。 12 只/组,组间不存在明显统计学差异。

1.3.2 大鼠胫骨骨折模型的建立

预实验后应用3%的戊巴比妥钠以40 mg/kg行大鼠腹腔内注射麻醉,左小腿术区备皮显露皮肤,常规消毒铺单。 于大鼠左小腿前外侧切开皮肤及皮下组织,顿性分离肌肉组织并充分暴露胫骨,并使用骨科线锯在胫骨中部横断制造简单骨折。 再使用细克氏针沿髓腔置入并固定远近骨折端。 骨折局部固定稳定,并间断缝合皮肤。 庆大霉素以50 000 U/d 肌注,每天一次,连续5 d。切口敷料局部包扎。

1.3.3 给药方式

各组均于术后第3 天在骨折断端周围局部经皮注射药物(于骨折线上方5 mm 左右,针头刺及骨面,向下滑至断端),1 次/天,连续7 d。 给药方式:A组100 ng bFGF+0.3 mL 生理盐水[6],B 组100 ng PDGF+0.3 mL 生理盐水[7],C 组100 ng bFGF+100 ng PDGF+0.3 mL 生理盐水,D 组0.3 mL 生理盐水。

1.3.4 标本采集及观察

在术后第2 周及第4 周从各组随机选取6 只大鼠,行患肢X 线摄片。 由我科室2 名副主任医师应用Lane-Sandhu X 线评分方法[8]对各组X 线片行骨折愈合评价。 采用评分者盲法,取两者平均值。

股动脉取血后将大鼠处死。 血液离心后将上清液放于-70℃冰箱待检。

将大鼠患肢切开并显露骨痂,在骨痂远近各1 cm处截取胫骨,留取骨痂标本。 行脱钙、中和、脱水、透明、浸蜡、切片、HE 染色、组织学观察。 利用多功能真彩色细胞图像分析管理系统计量分析骨小梁成骨指数(index of osteoblast,IOB)及平均骨小梁宽度(trabecular width,TW)。

1.3.5 ALP、VEGF、BMP-2 及IGF-1 含量的测定(蛋白质芯片法)

(1)预制蛋白质芯片

化学修饰化处理载体玻片,把点样缓冲液及抗体采用等比例混匀,再利用微阵列芯片点样仪进行点样以及蛋白固定等处理。 4 种待测目标抗体进行3 点重复点样,同时留取3 个空白对照点。 在37℃环境中把抗体蛋白固定并抽真空完成后再进行干燥及抽真空塑封处理。 芯片置于4℃保存。

(2)蛋白质芯片的检测

利用Smart ArrayerTM微阵列芯片点样仪进行蛋白芯片的制作。 把蛋白芯片连同标本一起置于室温下复温并保持20 min。 打开芯片的塑封膜并粘围栏后放入芯片槽中,并在槽的两侧倒入100 μL 左右的蒸馏水进行保湿。 加5%BSA 封闭液室温平衡30 min,点入血清30 μL、盖盖并固定稳定。 置于三维旋转杂交仪中37℃恒温反应1 h。 采用洗片仪进行洗片。 使用PBST 进行洗涤处理1 h。 将有CY3 荧光素的抗补体C3 二抗加入并进行反应。 再次37℃环境下孵育1 h。 再次洗片、干燥处理。 利用芯片阅读系统对蛋白芯片进行分析并进一步计算出四种检测目标的浓度。

1.4 统计学方法

本实验中的数据使用SPSS 22.0 进行统计分析处理。 数据采用平均数±标准差()表示。 将各组实验数据采用方差分析,采用LSD 法对组间进行两两比较。 Lane-Sandhu X 线评分采用重复测量方差分析。 检验水准α = 0.05,P ＜0.05 有统计学意义。

2 结果

2.1 大体观察

术后2 周观察可见:各组大鼠患肢内固定稳点,肢体力线可,但行动时均可见明显跛行。 术后4 周观察可见:A、B 组大鼠患肢骨折处有骨性骨痂形成；C 组有明显骨性骨痂形成,部分标本中甚至有骨桥形成；D 组大鼠可见少量骨性骨痂出现。

2.2 X 线片表现

术后2 周摄片:D 组骨折处局部骨折线清晰；A、B、C 组骨折线模糊,骨折间隙小,C 组优于其他组(图1)。

术后4 周摄片:D 组骨折线仍清楚可见；A 组和B 组大鼠患肢骨折线基本消失,可见外骨痂；C 组骨折线明显消失(图2)。

术后各观察点的Lane-Sandhu X 线评分可见:C组得分均高于其他各组,且实验组A、B 两组也均高于对照组D 组且差异有统计学意义,A、B 组间无统计学差异(P＞0.05)。 (见表1)

2.3 组织学观察

术后2 周:A、B 及C 组骨折处均可见纤维性骨痂和软骨性骨痂形成,可见新生骨小梁、新生血管形成,A、B 两组间无明显差异,C 组最优； D 组可见纤维骨痂和部分软骨骨痂形成(图3)。

术后4 周:A 组和B 组骨小梁增多并交织成网格状,局部有部分成熟板层骨形成,髓腔中存在部分骨髓细胞；C 组可见成熟板层骨,髓腔内出现大量骨髓细胞；D 组骨小梁欠成熟(图4)。

2.4 骨痂骨组织计量与分析

各观察点中,C 组标本中骨痂内IOB 值及TW值均优于其他各组,A、B 组大于D 组,且有统计学意义。 A、B 组间无统计学差异(P＞0.05)。 (见表2、表3)

2.5 血清中ALP 含量的检测

ALP 的含量于术后2 周及4 周时C 组最高,有统计学意义(P＜0.05)。 术后2 周可见:A、B 组均大于D 组但低于C 组(P＜0.05),A、B 组间无统计学差异。 术后4 周结果示:A、B 及D 组三组间无明显差异(P＞0.05)。 (见表4)

图1 术后2 周各组代表性X 线表现Note.A, bFGF group.B, PDGF group.C, bFGF + PDGF group.D, control group.Figure 1 Representative X-ray performance of each group 2 weeks after surgery

表1 术后各组Lane-Sandhu X 线评分()Table 1 Lane-Sandhu X-ray score of each group after operation

表1 术后各组Lane-Sandhu X 线评分()Table 1 Lane-Sandhu X-ray score of each group after operation

注:A、B、D 组与C 组比较*P＜0.05；A、B 组与D 组比较#P＜0.05；2周PAB=0.341, 4 周PAB=0.742。Note.Group A, B, and D compared with Group C,*P＜0.05.Groups A and B compared with Group D,#P＜0.05.2 weeks PAB=0.341,4 weeks PAB=0.742.

组别Groups 2 周2 weeks 4 周4 weeks A 3.83±0.75*# 6.33±0.52*#3.50±0.55*# 6.17±0.75*#C 4.67±0.52 9.00±1.09 D 1.33±0.52* 3.83±0.98*B

2.6 血清中VEGF 的含量

术后2 周时,A、B、C 组VEGF 的含量均高于D组,C＞B＞A＞D 组,有统计差异(P＜0.05)。 术后4 周时, C 组高于其他各组(P＜0.05)。 A、B、D 各组间无统计学差异(P＞0.05)。 (见表5)

2.7 血清中BMP-2 的含量

术后2 周时C＞B＞A、D(P＜0.05)。 A 组与D 组组间比较无明显差异(P＞0.05)。 术后4 周结果显示:四组组间均无明显统计学差异(P＞0.05)。 (见表6)

2.8 血清中IGF-1 的含量

术后2 周时,C＞B＞A＞D,且差异存在统计学意义(P ＜0.05)。 术后4 周时, C 组大于其他各组(P ＜0.05),其余三组组间无统计学差异(P＞0.05)。 见表7。

3 讨论

如何促进骨折愈合一直以来都是困扰骨科医生的一个难题。 在以往的研究中,Martijn Hofman等[9-10]提出:在重度的颅脑外伤之后,患者的血清与脑脊液中均可见检测出一些细胞因子较正常人水平明显增高,并认为这些因子在加快骨折愈合的过程中发挥了作用。 这其中就包括具有驱化成骨作用的bFGF 及PDGF。 已有研究证明局部单独注射这两种因子可以促进骨折愈合。 这也给了我们启发,局部注射生长因子可以是一种简单有效的治疗手段,是否可以通过局部注射多种因子而起到促进或抑制骨折愈合的作用呢,又或者其促进骨折愈合的机制是什么。 目前对于这些还没有答案,因此本实验选用两种因子,通过观察其联合应用后的作用来研究其对大鼠胫骨骨折愈合过程的影响作用,探寻其作用的机制。碱性成纤维细胞生长因子是已经被证实的可以促进成骨作用的一种多肽,具有促进成骨细胞的增殖与分化并加速钙盐的沉积的作用[11]；此外其还有很强的刺激血管再生的作用,并在骨折愈合过程的早期表达[12-13]。 Wildburger 等[14]人发现:严重脑外伤合并长骨骨折的患者血清中bFGF 的含量比单纯骨折组高。 顾熊华等[15]则将bFGF 局部注射在兔桡骨骨折处并证实了bFGF 的加速骨折愈合的作用。

图2 术后4 周各组代表性X 线表现Note.A, bFGF group.B, PDGF group.C, bFGF + PDGF group.D, control group.Figure 2 Representative X-ray performance of each group 4 weeks after surgery

图3 术后2 周各组代表性组织学表现(HE)Note.A, bFGF group.B, PDGF group.C, bFGF + PDGF group.D, control group.Figure 3 Representative histological findings of each group 2 weeks after operation

图4 术后4 周各组代表性组织学表现(HE)Note.A, bFGF group.B, PDGF group.C, bFGF + PDGF group.D, control group.Figure 4 Representative histological performance of each group 4 weeks after operation

表2 术后2 周各组痂中骨组织形态测定分析()Table 2 Analysis of bone tissue morphology in scabs of each group 2 weeks after operation

表2 术后2 周各组痂中骨组织形态测定分析()Table 2 Analysis of bone tissue morphology in scabs of each group 2 weeks after operation

注:A、B、D 组与C 组IOB 及TW 比较,*P＜0.05；A、B 组与D 组比较#P＜0.05；I0B(PAD=0.013,PBD=0.003,PCD=0.000)。Note.Group A, B, and D compared with IOB and TW in Group C,*P ＜0.05.Group A and B compared with group D,#P ＜0.05.I0B (PAD =0.013, PBD=0.003, PCD=0.000).

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表3 术后4 周各组骨痂中骨组织形态测定分析()Table 3 Analysis of bone tissue morphology in callus at 4 weeks after operation

表3 术后4 周各组骨痂中骨组织形态测定分析()Table 3 Analysis of bone tissue morphology in callus at 4 weeks after operation

注:A、B、D 组与C 组比较, *P ＜0.05；A、B 组与D 组比较, #P ＜0.05；I0B(PAD,PBD,PCD均＜0.05)。Note.Group A,B,and D compared with Group C,*P＜0.05.Groups A and B compared with Group D,#P＜0.05.I0B(PAD＜0.05,PBD＜0.05,PCD＜0.05).

组别Groups骨小梁成骨指数(mm2)IOB Trabecular bone formation index平均骨小梁宽度(μm)TW Trabecular width A 298.36±14.11*# 64.25±4.09*#B 304.90±15.23*# 65.33±5.23*#C 338.65±17.39 73.57±5.02 D 231.33±13.98* 50.56±3.27*

表4 各组血清中ALP 的含量()Table 4 The content of ALP in serum of each group

表4 各组血清中ALP 的含量()Table 4 The content of ALP in serum of each group

注:A、B、D 组与C 组比较, *P ＜0.05；A、B 组与D 组比较, #P ＜0.05。 2 周(PAD = 0.022,PBD = 0.003,PCD = 0.000)；4 周(PAC =0.005,PBC=0.027,PCD=0.007)。Note.Group A, B, and D compared with Group C,*P＜0.05.Groups A and B compared with Group D, #P ＜0.05.2 weeks(PAD =0.022,PBD =0.003,PCD=0.000).4 weeks(PAC=0.005,PBC=0.027,PCD=0.007)

组别Groups血清中ALP 的含量(ng/mL)Serum ALP content 2 周2 weeks 4 周4 weeks A 140.68±15.14*# 103.68±13.86*B 152.16±13.57*# 112.99±12.69*C 318.13±19.21 134.48±15.44 D 114.12±18.02* 106.29±16.69*

表5 各组血清中VEGF 的含量()Table 5 Serum VEGF content in each group

表5 各组血清中VEGF 的含量()Table 5 Serum VEGF content in each group

注:A、D 组与B 组比较,◆P＜0.05；A、B、D 组与C 组比较,*P＜0.05；A、B 组与D 组比较,#P＜0.05。 2 周(PAC=0.000,PBC=0.000,PCD=0.000,PAB=0.019)；4 周(PAC=0.000,PBC=0.000,PCD=0.000)。Note.Group A and D compared with Group B,◆P＜0.05.Group A, B and D compared with Group C,*P＜0.05.Group A and B compared with Group D,#P＜0.05.2 weeks(PAC =0.000,PBC =0.000,PCD =0.000,PAB=0.019).4 weeks(PAC=0.000,PBC=0.000,PCD=0.000).

组别Groups血清中VEGF 的含量(pg/mL)Serum VEGF content 2 周2 weeks 4 周4 weeks A 238.25±15.33*#◆ 222.96±14.16*B 266.40±18.52*# 230.85±13.59*C 344.61±18.19 285.97±16.92 D 211.15±18.48*◆ 208.06±15.91*

表6 各组血清中的BMP-2 含量()Table 6 BMP-2 content in serum of each group

表6 各组血清中的BMP-2 含量()Table 6 BMP-2 content in serum of each group

注:A、D 组与B 组比较,◆P＜0.05；A、B、D 组与C 组比较,*P＜0.05。2 周(PAD=0.021,PBD=0.035,PCD=0.001,PAB=0.039)。Note.Group A and D compared with Group B,◆P＜0.05.Group A, B and D compared with Group C, *P＜0.05.2 weeks(PAD=0.021,PBD=0.035,PCD=0.001,PAB=0.039).

组别Groups血清中BMP-2 的含量(pg/mL)Serum BMP-2 content 2 周2 weeks 4 周4 weeks A 106.62±14.73*◆ 103.31±15.78 B 122.67±13.61* 98.86±18.31 C 143.96±18.19 108.32±16.96 D 106.15±14.59*◆ 96.82±14.24

表7 各组血清中的IGF-1 含量()Table 7 IGF-1 content in serum of each group

表7 各组血清中的IGF-1 含量()Table 7 IGF-1 content in serum of each group

注:A 组B 组相比,◆P＜0.05；A、B、D 三组与C 组相,*P＜0.05；A、B组与D 组比较,#P ＜0.05。 2 周(PAD = 0.032,PBD = 0.001,PCD =0.000,PAB=0.011,PAC = 0.000,PBC = 0.004)；4 周(PAC = 0.000,PBC=0.001,PCD=0.000)。Note.Group A compared with Group B,◆P ＜0.05.Group A, B and D compared with Group C,*P＜0.05.Group A and B compared with Group D,#P＜0.05.2 weeks(PAD=0.032,PBD=0.001,PCD=0.000,PAB=0.011,PAC=0.000,PBC=0.004).4 weeks(PAC=0.000,PBC=0.001,PCD=0.000)。

组别Groups血清中IGF-1 的含量(pg/mL)Serum IGF-1 content 2 周2 weeks 4 周4 weeks A 310.42±18.65*#◆ 298.23±17.09*B 337.67±16.39*# 302.53±18.56*C 381.06±27.89 343.29±16.03 D 290.36±14.41* 287.39±13.92*

血小板衍生生长因子是一种于血小板中提取出的成骨因子。 其主要有两种功能:促进血小板、成纤维细胞等有丝分裂；对成骨细胞等有很强的驱化作用[16]。 其可以调节VEGF 的表达,促进损伤组织的修复与重建[17]。 徐亚青[18]等人通过实验认为:在大鼠骨折愈合过程的早期及中晚期均检测到PDGF 以及PDGF mRNA 的表达增强,因此可以认为PDGF 的表达在骨折修复的全程中均起作用。 此前已有学者[19]证明局部使用该药物使糖尿病大鼠的骨折修复过程加快。

本实验中我们分别对大鼠胫骨骨折的大体标本、影像学及组织学进行了分析,结果可见:首先,在术后2 周及4 周,实验组骨痂大小均优于对照组,且骨折线消失快,Lane-Sandhu X 线评分均高于对照组,骨痂组织的成熟度高,骨痂内IOB 值及TW 值均较高。 其次,C 组在各观察点的实验数据在上述观察指标中均高于其他三组。 因此我们不难看出,在本实验中单独将bFGF 或PDGF 应用于骨折局部具有加速骨折愈合的作用,且与Al-Zube 的观点一致；此外,在骨折局部联合使用bFGF 及PDGF 可产生优于单独使用时的促进骨折愈合的作用。

在本实验中我们不仅研究了两种药物局部及联合应用对骨折愈合过程的作用,我们还设立了四个观察指标:ALP、VEGF、BMP-2 及IGF-1。 碱性磷酸酶(ALP)是一种含锌糖蛋白,其表达于人体多种组织器官中,且研究表明ALP 参与了成骨作用并可反映骨折的修复与重建。 李建明等[20]认为:ALP 在机体中的水平可以作为骨折愈合过程的初期反映骨折愈合能力的一种简单而准确观察指标。 本实验发现:联合应用bFGF 和PDGF 对ALP 的表达具有同向促进作用。 ALP 一直被认为是能够早期了解骨折愈合过程中的成骨及骨钙化活动的一种因子。 这也说明了联合用药较优的促成骨作用。

血管内皮生长因子是人们研究发现的一种可以促进血管再生与修复的关键因子。 Pi 等[21]人则通过实验证明:VEGF 的表达可以增强骨形态发生蛋白9 诱导的成骨分化和骨形成,继而产促进骨折愈合。 本实验发现:单独应用bFGF 或PDGF 可使血清中VEGF 表达增强,但PDGF 的作用比bFGF强；联合应用使VEGF 表达更强。 bFGF 与PDGF 同向增强VEGF 的表达,或许是其联合作用过程中促进骨折愈合的作用机制之一。 BMP-2 是被证实的在骨折愈合过程的早期便可以单独介导间充质细胞成骨分化的因子,骨组织形成的关键调控因子,缺少BMP 的表达就不能产生成骨作用[22]。 Hara等[23]人通过研究发现BMP 可以促进骨折愈合,也是骨折愈合过程中重要的检测指标。

在本实验中局部应用bFGF 并未对血清中BMP-2 表达产生明显影响；而应用PDGF 则可增强BMP-2 的表达效果；但当联合使用二者是,则表现出了更强的BMP-2 表达。 因此我们对实验结果分析认为:bFGF 可以增强PDGF 对大鼠BMP-2 的表达的促进作用。 bFGF 增强PDGF 对BMP-2 的表达或许是联合过程中加速骨折的一种机制,但其是通过何种途径调节PDGF 功能仍需进一步研究。

IGF-1 被认为是一种介导生长激素发挥作用的活性蛋白多肽。 Locatelli 等[24]认为IGF-1 参与了调控细胞分化成骨,促进了ALP 的表达及骨矿化。 吴文侠等[25]报道:在脑外伤合并骨折的大鼠模型中,其骨痂中IGF-1 的表达明显高于单纯骨折组,并认为其加速了骨折的修复。 通过本实验可以看出:分别使用这两种药物可以提高大鼠血清中IGF-1 的表达,联合使用可使该作用更明显,也加速了骨折的愈合。 因此,bFGF 与PDGF 对增强大鼠IGF-1 的表达有同向促进作用。 因此,这或许也是其加速骨折愈合的另一种作用机制。

综上所述,骨折部位局部联合应用bFGF、PDGF可以较单独应用明显的促进骨折的愈合过程。 联合使用bFGF 及PDGF 两种药物还可以提高大鼠血清中ALP、VEGF、BMP-2 及IGF-1 四种因子的表达水平,且具有同向促进作用。 这或许是联合应用bFGF 与PDGF 促骨折愈合较优的机制之一,促进骨折局部新生血管形成,改善局部血运,促进骨基质的形成,并增强ALP 的活性,形成骨钙素,促进成骨[26]。

在实验中我们使用蛋白质芯片技术来高效、准确的检测血清中的多种指标。 蛋白质芯片是一种高通量定量分析、快速、并行的检测方法。 目前该方法仍仅多用于肿瘤指标的筛查等工作,对骨科领域的多因子检测使用仍较少。 我们创新性的将其用于骨科实验中,也为其他实验工作的多因子检测提供参考方法。

本实验证为临床早期干预治疗骨折不愈合或延迟愈合患者提供了实验参考。 但本实验对骨折愈合的评价仍存在不足。 Micro-CT 是目前一种能细微观察并定量分析骨折局部骨小梁变化的方法,其具有良好的空间分辨率。 除了应了解骨折局部微观变化外,机械力学的改变也可以反映其机械功能的修复情况。 以上两种方法因实验器械限制未能应用在本实验中,后期需不断完善相关实验工作。 此外,两种是否存在更优的联合药物选择也仍需进一步探究。