藜麦茎段组培快繁体系的建立

段鹏慧 ，李小艳 ，焦 茹 ，邓 妍 ，王创云

（1.山西林业职业技术学院，山西太原030009；2.山西省农业科学院作物科学研究所，山西太原030031）

藜麦（Chenopodium quinoaWilld）别名南美藜、奎藜、奎奴亚藜，属1 年生藜科双子叶植物，原产于南美洲，是印加人的主要粮食作物，被称为“粮食之母”。藜麦蛋白含量高于普通谷物，尤其富含人体必需的氨基酸、矿质营养、维生素E、类黄酮等生物活性物质[1-2]，营养丰富。目前，藜麦在美国、日本、欧洲等地开发利用前景较高[3]。

藜麦是我国引进的新型农作物，近年来，在我国甘肃、山西、青海、河北、吉林等地已开展了大面积的栽培生产[4-5]，在藜麦化学组成、营养成分、种质资源、栽培技术等方面也进行了一系列基础研究工作，育种工作尚处于初级阶段。藜麦为异源四倍体（2n＝4x＝36）[6]，自然异交率为 10%～17%，群体的基因组成多为杂合型，遗传不稳定。而植物组织培养技术能够保持母本的遗传性状，解决藜麦优良品种有性繁殖性状分离的问题。俞涵译等[7]研究了藜麦茎段愈伤组织的诱导及优化体系；曹宁等[8]研究了藜麦茎段愈伤组织分化和不定芽增殖。目前，国内有关藜麦组培快繁的研究报道相对较少。

本试验以藜麦带腋芽茎段为外植体，针对腋芽诱导、不定芽增殖、生根和移栽的影响因素进行研究，以期深入探索藜麦再生组培与快繁体系的建立，为生产中短期内快速繁殖优质藜麦种苗提供一定技术支撑。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试藜麦材料为HQ1，由山西华青藜麦产品开发有限公司提供。以藜麦幼苗期生长健壮、无病虫害的植株为母本，切取直径0.3～0.7 cm 茎段作为外植体。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的准备与消毒 将外植体材料去除叶片，用软毛笔蘸取饱和洗衣粉水将其清洗干净，然后流水冲洗30 min，剪成长度为1.5～2.0 cm 的带腋芽茎段（腋芽上下至少保留0.5～1.0 cm）；然后，在超净工作台中，用75%的酒精浸泡30 s，再用0.1%HgCl2进行常规消毒处理 3、5、7、9、11、13 min，随后用无菌水漂洗6 次，每次3 min；后立刻接种于MS 基本培养基上，每个处理接种30 瓶，每瓶1 个外植体。接种后7～10 d 统计外植体的污染率、成活率及死亡率，分析0.1%HgCl2不同消毒时间处理的效果。

1.2.2 诱导腋芽萌发 将生长状态良好的无菌单芽茎段接种至MS 附加有不同浓度细胞分裂素6-BA、生长素NAA 的初代诱导培养基上（表1），研究6-BA 和NAA 对藜麦腋芽萌发的影响，以筛选适宜的初代培养基。每处理10 瓶，每瓶2 株，重复3 次。接种7 d 后观察腋芽萌发情况，统计萌芽率。

表1 激素配方筛选试验设计

1.2.3 增殖培养 将腋芽萌发的初代苗切成带1～2 个叶片的茎段，接种于增殖培养基上。培养基以 MS＋NAA 0.2 mg/L 为对照（CK），添加质量浓度分别为 0.5、1.0、2.0 mg/L 的细胞分裂素 6-BA 和KT，共设6 个处理，即A.6-BA 0.5 mg/L；B.6-BA 1.0 mg/L；C. 6-BA 1.5 mg/L；D. KT 0.5 mg/L；E. KT 1.0 mg/L；F.KT1.5 mg/L，以探究不同激素不同浓度对不定芽增殖的影响。每处理10 瓶，每瓶3 株。15 d后，观察增殖情况，并统计增殖系数。

1.2.4 生根诱导 将高度为3～5 cm 的健壮芽苗转接至1/2 MS 附加不同质量浓度生长素IBA（0、0.5、1.0 mg/L）、NAA（0、0.5、1.0 mg/L）的培养基中进行生根培养。每处理10 瓶，每瓶3 株。15 d 后观察生根情况，并统计生根率。

1.2.5 驯化移栽 选择根长2～4 cm、株高5 cm 以上、长势健壮、根系良好的藜麦生根组培苗，温室中炼苗7～14 d；然后洗净根部培养基，迅速移栽至已充分消毒的基质中，基质设置5 种处理，分别是河沙、草炭土、蛭石、蛭石+草炭土体积比为3∶1 和蛭石＋草炭土体积比为2∶1。每处理10 瓶，每瓶3 株。移栽后置于通风、散光环境中养护，保持温度20～23 ℃、空气湿度80%～100%。20 d 后统计成活率并观察生长状况。

1.2.6 培养条件 以上培养基附加蔗糖30 g/L、琼脂 8 g/L，pH 值 5.8；培养温度（20±2）℃，空气湿度70%～80%，光照强度2 000 lx，光照时间13 h/d。

1.3 数据分析

试验数据采用Excel 2003 和SPSS 19 软件进行Duncan 检验和方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同消毒处理对藜麦茎段消毒的影响

接种3 d 后，部分处理外植体材料不同程度出现黏液状菌落，且随时间的延长，污染数量逐渐增多，菌斑面积扩大；15～25 d，污染数量不再上升；但是接种 7 d 后，9、11、13 min 消毒处理的少量外植体材料颜色由绿转黄，继而变为褐色、黑色，最后枯死。

由表2 可知，酒精消毒时间保持不变时，随着HgCl2处理时间的增加，外植体污染率逐渐降低，其中，HgCl2处理3 min 的污染率最高，达43.3%，且与其他5 个处理间差异显著；HgCl2处理13 min 污染率为0，但死亡率最高，为33.3%，且与其他各处理间的差异达显著水平；HgCl2消毒处理9 min 成活率最高，为83.3%，但与HgCl2消毒处理7、11 min间差异不显著，与另外3 个处理间差异显著。选择成活率最高的处理即75%酒精30 s＋0.1% HgCl29 min 作为藜麦腋芽最佳的灭菌方案。

表2 不同消毒处理对外植体的影响

2.2 不同激素及浓度对藜麦腋芽萌发的影响

培养8～10 d，各个处理腋芽开始膨大，出现淡绿色圆突状芽点；25 d 后芽点陆续萌发展叶，多数腋芽萌发的嫩茎长4～7 mm；30 d 后芽可长至10～23 mm，基部直径3～5 mm。从表3 可以看出，处理7（培养基为 6-BA 1.5 mg/L＋NAA 0.5 mg/L）的萌芽率最高，达90%，该处理下，发芽最快，芽饱满且长势好。

方差分析结果表明（表 4），6-BA、NAA 及二者的交互作用对藜麦腋芽萌发均有显著影响，F值由大到小依次为 261.083（6-BA）、28.583（NAA）和5.958（二者的交互作用），说明6-BA 对腋芽诱导的影响最大，NAA 次之，二者的交互作用最小。

表3 不同激素诱导藜麦腋芽的萌发情况

表4 不同浓度6-BA 和NAA 组合腋芽萌芽率的方差分析

为进一步探明不同因素各水平间的差异情况，采用新复极差法（Duncan）进行多重比较，结果表明（表 5），6-BA 不同水平中，1.5 mg/L 的萌芽率最高，且相对于1.0、0.5 mg/L 对藜麦腋芽萌发明显提高，并达到差异显著水平；NAA 不同水平中，0.5 mg/L的萌芽率最高，且与1.0、0.1 mg/L 间差异达显著水平，说明 1.5 mg/L 6-BA、0.5 mg/L NAA 对藜麦腋芽萌发作用较强。

表5 6-BA、NAA 各水平的差异显著性分析

综上，确定藜麦腋芽诱导的最佳培养基为MS＋6-BA 1.5 mg/L＋NAA 0.5 mg/L。

2.3 不同激素及浓度对不定芽增殖的影响

培养13 d 后，无菌茎段开始出现新芽；25 d 左右多数处理的不定芽数量逐渐增多，生长状况不一；继续培养，部分不定芽陆续抽出茎、叶。

由图1 可知，添加激素的培养基中，不定芽增殖系数至少是对照（0.6）的3 倍以上，且差异均达显著水平；同一种激素随着浓度的增加，不定芽增殖系数呈逐渐上升趋势，但1.0、2.0 mg/L 这2 个梯度间差异不显著，二者较0.5 mg/L 梯度差异均显著；6-BA 较 KT作用明显，1.0、2.0 mg/L 6-BA 的不定芽增殖系数显著高于同一梯度KT 的增殖系数；6-BA质量浓度上升至2.0 mg/L 时，增殖系数最高，为4.9，但是芽苗纤弱、叶片小，长势较弱。因此，MS＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L 是最适宜的增殖培养基。

2.4 不同生根培养基对藜麦芽苗生根的影响

培养15 d 左右，陆续可见从试管苗基部分化出少量白色不定根；约25 d 后，分化较早的不定根又产生须根，根长约2～5 cm。从表6 可以看出，生长素为0 mg/L（CK）时，试管苗生根率仅为16.7%，不定根数量较少，生根慢，且与其他处理的差异达到显著水平；同一浓度水平的IBA，单独使用与IBA和NAA 配合使用相比，生根率差异不显著；同一浓度水平的NAA，NAA 和IBA 配合使用的生根率显著高于NAA 单独使用；生根率随着IBA 浓度增加而增加，即1.0 mg/L＞0.5 mg/L＞0。当IBA为1.0 mg/L时有愈伤组织产生，不定根由愈伤组织发出，根易折；当 IBA 为 0.5 mg/L、NAA 为 0 时，生根率为 76.7%，但不定根数量多，根较粗壮，移栽成活率较高。综合考虑生根率、不定根数量及根长等因素，确定藜麦适宜的生根培养基为1/2 MS＋IBA 0.5 mg/L。

表6 不同培养基对藜麦生根的影响

2.5 基质类型对藜麦组培苗移栽的影响

试验结果表明（图2），蛭石与草炭土混合基质的移栽成活率、生长高度较河沙、草炭土、蛭石的效果明显，且差异达显著水平；蛭石＋草炭土体积比为3∶1 处理的组培苗成活率为93.3%、生长高度为2.86 cm，达到最佳效果，与蛭石＋草炭土体积比为2∶1 处理相比差异达显著水平；草炭土的组培苗成活率最低，仅有58.3%；河沙的生长高度最小，为1.32 cm。因此，适合试管苗移栽的基质为蛭石和草炭土体积比为3∶1。

3 结论与讨论

3.1 外植体的消毒

植物组织培养中，获得无菌体系是组培成功的首要条件[9]。本研究以藜麦幼苗期带腋芽茎段为外植体材料，采用75%酒精消毒处理30 s、0.1%的HgCl2不同时间梯度消毒，随HgCl2消毒时间加长，污染率逐渐降低，消毒效果明显；但过度消毒会加重外植体伤害程度，造成外植体失活死亡，腋芽启动受到影响。因此，综合考虑消毒后外植体材料的成活情况，确定75%酒精消毒处理30 s、0.1%的HgCl2消毒处理9 min 是藜麦带腋芽茎段的最佳消毒方案，该条件下，成活率达83.3%，长势良好。

3.2 植物生长调节物质对藜麦组培的影响

植物生长调节物质的种类与浓度是芽诱导、增殖及生长发育的关键因素。细胞分裂素、生长素能明显促进腋芽启动与生长。有研究表明，6-BA 对不定芽诱导起主导作用，添加适量6-BA 有利于不定芽的形成[10-12]。生长素NAA 对不定芽诱导效果并不是随NAA浓度的升高而增强，与生长素特性有关[13]。在一定范围内，高浓度细胞分裂素6-BA 与低浓度生长素NAA 有利于芽的形成。本研究表明，当培养基中 6-BA 为 1.5 mg/L、NAA 为 0.5 mg/L 时，藜麦诱导率最高，达90.0%，且芽萌发最快，芽体饱满，色泽绿。

本研究表明，高浓度6-BA、KT 与低浓度NAA的激素组合的藜麦试管苗带芽茎段的增殖系数较高。这与洪森荣等[14]在香果树上的试验结果基本一致。细胞分裂素对不定芽的增殖有促进作用，其中，6-BA 的增殖作用较KT 好，这与孙骏威等[15]的研究结果一致。本研究表明，MS＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L 增殖培养基中，藜麦不定芽增殖系数最高，为4.9，芽苗健壮，长势良好。

大量研究表明，生长素在生根培养中占据主导地位，不同种类、不同浓度生长素的诱导生根能力存在明显差异[16-17]。本试验中，不添加生长素时，藜麦组培苗生根率仅有16.7%；单独添加IBA、NAA及二者配合使用均能有效诱导藜麦组培苗产生不定根，但IBA 处理较NAA、IBA＋NAA 的生根率高，生根效果好，根粗壮；IBA 为1.0 mg/L 处理的生根率较IBA 为0.5 mg/L 处理高，但不定根发自愈伤组织，根易折，移栽后植株成活率降低[18-19]。因此，确定藜麦诱导不定根的最佳培养基为1/2 MS＋IBA 0.5 mg/L。

3.3 驯化移栽

驯化移栽是植物组织培养最为关键的阶段，移栽基质要求疏松、透气、透水，有一定肥力[20]。本研究表明，藜麦组培苗在5 种不同移栽基质中的成活率、生长情况差异明显。蛭石∶草炭土体积比为3∶1 时，移栽成活率可达93.3%、生长高度为2.86 cm，原因可能是由于草炭土营养丰富、保肥能力好，而蛭石透水透气性强，二者比例恰当，有利于藜麦幼苗生长。