氧化石墨烯介导多功能G-四链体发夹探针用于转录因子的高灵敏检测

褚秀玲

（山东省泰安生态环境监测中心，山东 泰安 271000）

人类细胞中含有超过1000种转录因子。它们浓度异常变化与许多疾病紧密相连［1］。例如，NF-κB（存在于人体各种细胞内的一类转录因子）的异常表达将会导致癌症、炎症等严重疾病［2，3］，已经用于临床诊断和开发相关治疗药物。所以，灵敏、快速检测NF-κB的活性具有非常重要的现实意义。近年来，荧光检测技术已被用来检测转录因子。最常用的是基于构象转变的荧光检测分析方法。该方法过程简便，但是必须构建结构复杂的探针，大大限制了该方法的应用范围。氧化石墨烯（graphene oxide，GO）是一种特殊的二维碳纳米材料，具有良好的水溶性、优异的机械及热性能［4］。GO能够吸附单链DNA，并可以淬灭DNA单链上标记的荧光，已被用于开发多种生物传感器［5-8］。本文设计一种具有三重功能的G-四链体发夹探针，借助GO对DNA单链的高效率吸附和淬灭荧光性能，建立了一种快速、简单、灵敏的荧光检测NF-κB p50方法，获得了满意结果。

1 实验部分

1.1 试剂

本文用到的探针（DNA）均由上海生工提供，如表1所示。重组 NF-κB p50购于美国 Cayman Chemical公司，氧化石墨烯水溶液购于南京先丰纳米材料科技有限公司，NMM购自Frontiersci。其它试剂均购自上海国药集团。

DNA储存液（TE）：10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 8.0。

所用溶液均采用高纯水（＞18.25 MΩ）配制。

表1 探针序列Table 1 Details of the DNA sequences of PROBE

表1中粗体为发夹的茎部（即为目标物的识别序列），下划线区域为发夹的环部，斜粗体部分为探针末端G-四链体。

1.2 DNA的分装、储存及工作溶液的配制

将新购买的 DNA离心（10000v／min，1min），用TE缓冲液配制成50μmol／L的储备液，振荡使其充分溶解后分装，储存于-20°C备用。2.5μ mol／L的工作溶液由 10 m mol／L HEPES（50 m mol／L氯化钾，0.1 m mol／L EDTA，2.5 m mol／L二硫苏糖醇，10%甘油，pH＝7.4）缓冲溶液稀释储备液而成，置于-4°C。

1.3 氧化石墨烯吸附G-四链体探针、靶标结合探针、复合物的解离、插入染料及测定荧光

氧化石墨烯和G-四链体探针依次加入到20 mM HEPES的缓冲体系中，室温下吸附反应进行5 min，然后加入靶标NF-κB p50，室温下与识别探针结合后形成复合物，脱离氧化石墨烯，进行20 min。最后，加入染料NMM到反应体系中，5 min。体系的终体积为50μL，氧化石墨烯、探针和NMM的最终浓度分别为 0.1 mg／mL、50 nmol／L、2.0 μmol／L。测定荧光参数：激发电压为500 V，激发波长：399 nm，发射波长：620 nm，狭缝：5 nm。

2 结果与讨论

2.1 检测原理

检测原理如图1所示。G-四链体发夹探针具有三重功能，环部用于吸附于氧化石墨烯，茎部用于结合靶标，末端G-四链体用作输出信号载体。首先，探针通过π-π堆积作用被快速吸附到氧化石墨烯表面；然后，靶标NF-κB p50特异性结合探针茎部后形成复合物，复合物体积较大，与氧化石墨烯表面的相互作用力减弱，导致脱离其表面；最后，插入内插染料NMM（插入G-四链体后荧光信号增强）。靶标不存在时，吸附在氧化石墨烯表面的探针无法自行解离，插入NMM后仍会被氧化石墨烯淬灭，利用荧光变化可以实现对靶标分子的快速、灵敏检测。

图1 氧化石墨烯介导多功能G-四链体发夹探针高灵敏检测转录因子示意图Fig.1 Scheme of graphene oxide-mediated multifunctional G-quadruplex hairpin probe for rapid and sensitive detection of NF-κB p50

2.2 NF-κB p50分析的荧光光谱表征

检测过程中荧光强度的变化如图2所示。染料自身呈现荧光很微弱（a），当探针加入到含有染料NMM的体系时，荧光强度显著增大（d）。当氧化石墨烯加入体系后，荧光强度明显下降（b），这说明插入到探针中的NMM的增强荧光已被氧化石墨烯高效淬灭。当体系中加入靶标NF-κB p50后，荧光强度又显著增强（c），这说明探针与靶标特异结合成为复合物，体积变大产生位阻效应，与氧化石墨烯亲和力变弱，进而脱离从其表面解离，染料NMM的荧光恢复。

图2 检测过程中荧光强度的变化Fig.2 The change of fluorescence intensity

2.3 优化实验条件

为了获得最佳检测数据，需要优化实验条件，包括探针末端G-四链体长度、氧化石墨烯浓度、内插染料浓度。

2.3.1 G-四链体长度的优化

ΔF（阳性荧光强度与阴性荧光强度之差）随着G-四链体序列长度的增加而增大，当序列碱基数为17时，ΔF最大，因此，选择碱基数为17的G-四链体，对应探针4。

2.3.2 氧化石墨烯的浓度优化

氧化石墨烯的浓度对淬灭效率影响重大，氧化石墨烯浓度增大，荧光强度ΔF先增大后又逐渐降低，当浓度为0.1 mg／mL时ΔF最大。

2.3.3 内插染料浓度的优化

荧光强度随着NMM浓度的增大而增大，然后又逐渐变小，当染料浓度为2.0μmol／L时，荧光强度达到最大值。

2.4 检测方法性能

通过测定不同靶标浓度在最佳条件下对应的荧光强度，可以获得本检测方法的线性范围和灵敏度。荧光强度与目标物浓度在0.5～50 nmol／L范围内时具有线性关系（R2＝0.993），经估算检测限为0.25 nmol／L，优于文献报道的其他方法。

3 结论

本文通过设计基于氧化石墨烯高效淬灭性能的多功能G-四链体识别探针，成功构建了一种简单、灵敏、快速的荧光检测方法，实现了对靶标转录因子NF-κB p50的灵敏检测，LOD分别为0.25 nmol／L。与文献报道的其他荧光方法相比较，该检测方法具有如下特点：1）首次设计用于转录因子的检测的三功能识别探针，并且该设计具有通用性，只需要调整对应的识别序列即可实现其它靶标转录因子的高效检测。2）该方法不需要昂贵的切割酶，极大地降低了假阳性信号和检测成本。