非洲猪瘟诊断方法的研究进展

1 ASF病原学检测

1.1 红细胞吸附（HAD）试验红细胞吸附现象最早发现于1969年，是在病毒感染巨噬细胞过程中的出现的一种自然现象。感染了非洲猪瘟病毒的巨噬细胞会吸附在猪的红细胞表面，呈现出典型的“玫瑰花环”的形状。这种技术手段的灵敏度和特异性都很好，但是操作繁琐、对技术水平要求较高。目前已经有研究表明，有一些ASFV毒株不具有红细胞的吸附特性，对于这类毒株，用红细胞吸附试验就无法进行检测。

1.2 PCR技术目前，PCR技术是检测ASFV最为常用的检测手段，也是世界动物卫生组织指定的ASFV的检测方法。该技术是一种操作便捷、检测效率较高的分子生物学方法，只需要针对不同的基因片段设计相应的特异性引物，就可以快速检测出目的基因。具有快速检测、特异性强、灵敏度高的特点，并且对样品的纯度、血液样品及组织的保存方式要求较低。

ASFV是双链线性的DNA病毒，其基因组全长为170～190kb，利用ASFV VP73基因的高保守片段序列设计出特异性引物，在通过优化PCR反应的条件，组装了非洲猪瘟病毒的PCR检测试剂盒，该试剂盒的检测灵敏度高达0.1fg，利用双重PCR技术建立了检测非洲猪瘟和猪瘟的方法，最低检出量均可达到100pg。

1.3 荧光定量PCR技术实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时在线检测整个PCR反应进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的一种核酸定量检测技术。该技术与常规PCR相比，具有特异性强，自动化程度高，并且可以有效解决常规PCR污染等问题。

自2009年以来，我国多人陆续建立了多种荧光PCR法检测非洲猪瘟病毒。2010年，基于ASFV的VP73基因的保守区域，设计了特异性引物和Taqman探针，建立了非洲猪瘟荧光PCR检测方法，该方法的最低检测限为10个拷贝数/μL，与OIE推荐的荧光PCR检测方法灵敏度和特异性均相当。

利用ASFVCP530R基因的高保守序列，设计1对特异性引物和探针，建立了检测ASFV的TaqMan-MGB探针实时荧光PCR方法，该检测方法最低检测限为61个拷贝数/μL，利用该方法进行重复性检测，4次检测的变异系数均小于2.0%。通过对38份猪肉标本和126份进口猪的血液标本进行ASFV检测，结果均为阴性。

2 ASF血清学检测

2.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）ELISA技术作为目前国内外应用最为广泛的血清学诊断方法，具有快速灵敏、准确性高的优点，并且可以用于大规模样品的排查和疫病的监测。但是该方法具有一定的局限性，没有办法检测出早期的ASFV感染。依据Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，表达出ASFV P54蛋白，经过各反应条件的优化，建立了检测ASFV血清抗体的间接ELISA方法，该方法检测ASFV的灵敏度可达1∶320，并且具有操作简单、特异性强的特点。

2.2 胶体金免疫层析(GICA)法胶体金免疫层析(GICA)法的原理是将胶体金作为示踪标志物，应用于抗原抗体检测的一种新型的免疫标记技术。该技术具有较高的灵敏度，并且易于操作，适合在大规模排查中使用。通过利用 ASFV的p54蛋白抗原，成功建立了P54抗体胶体金检测法，制备了P54快速检测胶体金试纸条，该试纸条具有特异性强、灵敏度高的优点，非常适合用于基层疫病防控中。

综上所述，非洲猪瘟是一种传染性很强的出血性病毒传染病，目前还未研制出有效疫苗。该种疫病一旦在我国发展蔓延，会对我国的生猪养殖业及相关产业造成重大的冲击。随着我国畜牧业快速发展，防疫人员的数量和专业素质无法满足日益严重的防疫工作，一定程度上制约我国畜牧业持续健康发展。因此，快速灵敏的ASFV检测技术在我国基层的疫病检测中发展前景良好。随着我国对非洲猪瘟疫情的严防严控力度的不断加强，ASFV检测技术也将会不断发展和完善，为我国进一步开展ASFV的监测和防控奠定技术基础。