循环内皮祖细胞对围绝经期多囊卵巢综合征胰岛素抵抗的影响

杨阳 雷秀兵 刘丽君

(1攀枝花学院临床医学院，四川 攀枝花 617000；2攀枝花学院医学院；3四川省地矿局四○五医院妇产科)

多囊卵巢综合征(PCOS)是最常见的妇科内分泌和代谢性疾病，影响着5%的育龄妇女〔1〕，是导致不孕的重要原因之一。围绝经期女性大约有10%患有PCOS。该病的病因尚不完全清楚，临床表现极为多变，一般包括临床或生化性高雄激素血症、月经紊乱和多囊卵巢。患者往往具有糖、脂代谢异常，是代谢综合征的高危人群。代谢紊乱还可引起冠心病和糖尿病的风险增加，带来严重的远期损害。高胰岛素血症和胰岛素抵抗(IR)是PCOS自身发病的关键机制，研究数据表明无论肥胖或非肥胖的患者都有可能存在IR〔2～5〕。糖调节障碍与内皮祖细胞(EPCs)生物学异常密切相关，具体机制包括EPCs循环数量减少、骨髓动员功能缺陷及EPCs介导内皮修复功能的功能特性受损〔6，7〕。而内皮功能受损预示动脉粥样硬化早期变化，是未来心血管风险增加的显著标志。在2型糖尿病、代谢综合征患者血液中的EPCs水平降低，而且与疾病严重程度相关〔8，9〕。血管干细胞包括EPCs、平滑肌祖细胞(SMPCs)、周细胞和间充质干细胞等4种类型，其中EPCs是骨髓来源的循环细胞，表达造血干细胞抗原CD34和CD133，有分化为成熟内皮细胞的潜能，参与内皮修复过程。本研究观察IR对于肥胖和非肥胖围绝经期PCOS患者血管祖细胞数量、功能及其代谢的影响，阐明肥胖和非肥胖PCOS患者的临床特征。

1 材料与方法

1.1研究对象 选取2019年1～12月四川省地矿局四○五医院妇产科确诊为PCOS患者79例，平均年龄(48.5±5.8)岁，体重指数(BMI)≥25 kg/m2为肥胖组(n=43)，BMI<25 kg/m2为非肥胖组(n=36)；选择四川省地矿局四○五医院同期体检、年龄匹配的女性30名，作为对照组。纳入标准：①符合2003年美国与欧洲生殖协会制订的PCOS诊断标准〔10〕；②近3个月未服用激素类药物；③经医院伦理委员会批准。排除条件：①合并肝肾功能不全；②合并有恶性肿瘤、自身免疫性疾病等。用McAuley指数评价IR程度，按照McAuley指数<5.8和McAuley指数≥5.8分为IR和非IR。两组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2观察指标

1.2.1糖代谢、内分泌水平的血清学检测 患者入院后次日清晨抽取静脉血4 ml，3 000 r/min离心10 min后吸取上清液，置于-80℃备用。使用日立7600-020全自动生化分析仪测定空腹血糖(FPG)、餐后2小时血糖(2 hPG)及血清催乳素(PRL)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)。免疫透射法检测C反应蛋白(CRP)水平。比较两组IR指数(HOMA-IR)，计算公式如下：HOMA-IR=〔空腹胰岛素(FINS)×FPG〕/22.5，正常值<2.69。

1.2.2EPCs流式细胞术计数 收集受试者外周血2.4 ml，用氯化铵缓冲液裂解红细胞后，从外周血中分离出白细胞。暗处分别用CD133-PE、CD34-FITC 和CD45-PerCP (R&D System，Abondgon)抗体标记，室温孵育30 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次后重悬于500 μl PBS。在流式细胞仪贝克曼库尔特Navios进行检测，获取10 000个细胞，以占单个核细胞百分比表示。

1.2.3集落形成单位计数 取外周血10 ml，1 500 r/min离心15 min弃去上清，加入PBS 10 ml。取50 ml离心管，加入淋巴细胞分离液10 ml，按照1∶1体积加入细胞悬浊液。2 000 r/min离心25 min密度梯度离心获单个核细胞后，在6孔板中进行体外培养，培养于含有20%胎牛血清的DMEM低糖培养液中，置于37℃、5%CO2的培养箱中。4 d后更换培养液，弃去未贴壁细胞，加入含有50 ng/ml VEGF的DMEM培养液。7 d后计数EPCs集落形成单位。

1.2.4酶联免疫吸附试验(ELISA)测定炎性细胞因子 使用人血管内皮细胞生长因子(VEGF)白细胞介素(IL)-6(R&D，#DVE00，#D6050)等ELISA试剂盒检测患者血清中VEGF、IL-6浓度。所有步骤严格按照说明书，使用酶标仪在405 nm测定吸光值。

1.3统计学处理 采用SPSS13.0软件进行t检验、χ2检验、Pearson相关性分析。

2 结 果

2.1糖代谢和内分泌水平比较 围绝经期肥胖组FPG、2 hPG和HOMA-IR均明显高于非肥胖组，非肥胖组FPG、2 hPG和HOMA-IR均明显高于对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。PCOS患者IR总发生率为41.8%，肥胖组IR发生率明显高于非肥胖组，非肥胖组IR发生率明显高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。3组PRL、FSH水平比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，肥胖组与非肥胖组LH水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，但均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组糖代谢及内分泌水平比较

2.23组EPCs数量、集落形成单位比较 肥胖与非肥胖PCOS患者EPCs数量〔(0.04±0.01)%、(0.16±0.01)%〕、集落形成单位〔(49.70±9.21)%、(74.13±11.86)%〕均明显低于对照组〔(0.21±0.00)%、(75.35±10.76)%〕，差异均有统计学意义(均P<0.05)，组间比较显示肥胖组EPCs数量、集落形成单位明显低于非肥胖组，差异有统计学意义(P<0.05)，提示肥胖组EPCs数量明显减少。

2.33组CRP、VEGF、IL-6水平比较 肥胖组与非肥胖组CRP、VEGF、IL-6水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)；且肥胖组水平明显高于非肥胖组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组炎症因子水平比较

2.4循环EPCs数量与HOMA-IR的关系 PCOS患者循环EPCs数量与HOMA-IR呈负相关(r=-0.582，P<0.05)。

3 讨 论

目前学者已逐渐认识到IR参与PCOS发病过程，然而对于其发病机制仍缺乏确切阐明。围绝经期本身与体重增加和心血管风险增加有关，研究显示肥胖能促使IR状态下的PCOS患者的糖尿病发病率增加〔11〕。本研究证实围绝经期肥胖和非肥胖PCOS患者均可能存在IR，与既往国内外研究结果一致。本研究结果提示肥胖患者更易发生IR。LH的释放可促进肾上腺和卵巢分泌雄激素增加，加剧IR发生。

有研究表明，COPD患者循环EPCs数量与全身动脉内皮功能呈负相关，即循环EPCs数量较多，而血流介导性舒张较少，提示肺或体循环的血管损伤可能刺激骨髓并促进祖细胞的释放〔12〕。EPCs参与维持内皮细胞的稳态，并参与新生血管的形成，这一过程被称为新生血管形成。这些细胞保护心血管系统的机制尚不清楚，然而，一致的证据表明，EPCs的损伤和减少是1型和2型糖尿病的显著特征〔13〕。本研究结果表明围绝经期PCOS患者存在内皮数量减少。

CRP是急性时相蛋白，与PCOS女性的IR和内皮功能障碍有关〔14〕。VEGF是炎症和血管新生过程中的重要因子，该蛋白可由人类卵巢表达和分泌，在卵巢血管生成的生理调控中起重要作用〔15，16〕。此外，VEGF作为PCOS临床特征，在卵巢间膜和间质的高血供中起关键作用。减肥手术后的体重减轻可显著减少VEGF及其他炎症因子的产生〔17〕。IL-6在卵巢成熟和植入过程中起重要作用，先前研究表明IL-6与IR、肥胖有关〔18〕。PCOS大鼠模型中，IL-6升高可上调卵巢组织中睾酮受体的表达，间接增加雄激素活性，从而参与PCOS的发病机制〔19～21〕。

综上所述，围绝经期PCOS患者的糖代谢水平异常，以FPG、2hPG和HOMA-IR明显升高为表现。肥胖型患者糖代谢异常、IR更为严重，与EPCs减少有一定的关系。