硫氧还蛋白相互作用蛋白降低GLP-1促小鼠胰岛β细胞的增殖效应

张文婷，王 瑾，岳继萍，靳文文，张志楠，焦向英

(山西医科大学 生理学系，山西 太原 030001)

胰岛β细胞功能障碍[1]和数量减少[2]是糖尿病发病机制中的关键因素，因此，抑制胰岛β细胞数量减少，促进其增殖对糖尿病的治疗至关重要。

胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide 1，GLP-1)与GLP-1受体(GLP-1 receptor， GLP-1R)的结合可促进胰岛β细胞的增殖[3]，抑制其凋亡[4]。但GLP-1R在糖尿病中表达降低[5]，那么，糖尿病中GLP-1对胰岛β细胞的增殖效应是否会有变化？

糖尿病中硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)的表达显著上调[6]，且其不但可抑制肿瘤细胞[7]的增殖，还可下调核转录因子Mafa的表达[8]，而Mafa能够调节胰岛β细胞上GLP-1R的表达[9]，那么，GLP-1的增殖效应是否会受TXNIP的影响？因此，推测TXNIP可通过抑制GLP-1R的表达进而影响GLP-1对胰岛β细胞的增殖效应。为此，本研究在db/db鼠和MIN6细胞上进行探究，以期寻求糖尿病治疗新方向。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物、细胞及载体：SPF级C57BLKS/JNju db/m、db/db小鼠，雄性，体质量28～35 g[江苏集萃药康生物科技有限公司，生产许可证号SCXK(苏)2018-0008]；MIN6 C57BL/6小鼠胰岛β细胞株(北纳创联生物技术研究院)。慢病毒载体：pLV[shRNA]-mCherry: T2A: Puro-U>rTXNIP [shRNA#1]；pLV [Exp]-EGFP: Puro-Null；pLV [Exp]-EGFP: Puro-EF1A>rTXNIP [NM-001008767.1]，由广州赛业公司包装完成。

1.1.2 试剂：RPMI 1640培养基(Hyclone公司)，胎牛血清(Cellmax公司)，苏木精伊红(HE)染色试剂盒(碧云天生物技术有限公司)，GLP-1 ELISA试剂盒(博士德生物公司)，小鼠抗大鼠PCNA抗体和兔抗大鼠TXNIP抗体(CST公司)，豚鼠抗大鼠anti-insulin抗体、小鼠抗大鼠anti-glucagon抗体、兔抗大鼠anti-Ki67抗体和兔抗大鼠anti-GLP-1R抗体(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分组及处理：分为db/m组和db/db组小鼠，每组10只，常规饲养。

1.2.2 慢病毒转染MIN6细胞：选择对数期的MIN6细胞，分为对照组、Ad-GFP组和Ad-TXNIP-GFP组。各加2 mL 完全培养基，除对照组外，各组病毒分别加50 μL。约6 h后，每组换5 mL培养基。培养24 h后，显微镜下观察转染情况。待24 h后加入含3 μg/mL嘌呤霉素(puromycin, PM)的培养基进行抗性筛选，显微镜观察，当转染率达90%以上时，停止抗性筛选，表明TXNIP过表达稳转细胞株构建成功。在Ad-GFP组和Ad-TXNIP-GFP组中分别加入1×10-8mol/L GLP-1受体激动剂利拉鲁肽(liraglutide)，分为对照组、Ad-GFP组、Ad-TXNIP-GFP组、Ad-GFP+liraglutide组和Ad-TXNIP-GFP+liraglutide组，培养48 h，收集蛋白，检测PCNA和Ki67，n值为6。

1.2.3 Western blot检测TXNIP、PCNA和GLP-1R蛋白表达水平：在体水平，取0.05 g胰腺组织，加入500 μL裂解液(含PMSF 5 μL)，充分剪碎。离体水平，用200 μL含EDTA的胰蛋白酶消化MIN6细胞1 min，4 000 r/min离心，5 min，弃上清，每管加入100 μL裂解液和1 μL PMSF，吹散，细胞超声破碎仪破碎。4 ℃裂解、离心取上清，BCA法检测蛋白浓度。上样，电泳，转膜，封闭2 h，加一抗4 ℃过夜。二抗孵育2 h，曝光机曝光。用Image J 得各个条带吸光度值，以β-actin为内参进行分析。

1.2.4 免疫组织化学检测GLP-1R蛋白表达水平：取新鲜的胰腺组织固定，包埋，切片。烤片后二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱水。用双氧水灭活，柠檬酸钠进行抗原修复，5% BSA血清封闭，4 ℃孵一抗过夜。孵育生物素化二抗，孵育SABC，DAB显色，苏木精染核，中性树胶封片。

1.2.5 HE染色观察胰岛结构：按照苏木精伊红(HE)染色试剂盒说明书进行操作。

1.2.6 组织免疫荧光双标检测胰岛细胞的数量：胰腺组织冰冻切片，丙酮-20 ℃固定20 min，滴加10%山羊血清37 ℃封闭30 min。滴加一抗，4 ℃过夜。避光滴加荧光二抗，37 ℃孵育1 h，滴加含DAPI的防衰减封片剂，封片。

1.2.7 夹心法酶联免疫吸附试验检测小鼠血清中GLP-1的表达：加100 μL小鼠血清和标准品，37 ℃反应90 min。加生物标记抗体，37 ℃反应60 min，加ABC工作液，37 ℃反应30 min，加90 μL TMB显色液，37 ℃避光反应20～25 min。加TMB终止液，用酶标仪在450 nm处测定A值并计算其浓度。

1.2.8 细胞免疫荧光检测GLP-1R和Ki67蛋白表达水平：取对数增殖期细胞，消化，爬片，待24 h后，多聚甲醛固定15 min，0.05% Triton-100室温通透40 s，滴加10%山羊血清，37 ℃封闭30 min，孵一抗，过夜。避光孵二抗，室温避光1 h，滴加抗衰减封片剂，室温孵育5 min后，拍片。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 db/db鼠胰岛结构破坏且β细胞数量减少，胰腺组织PCNA表达降低

db/db鼠胰岛形状不规则，结构破坏严重(图1A)。与db/m鼠相比，db/db鼠胰岛β细胞数量减少(图1B)。db/db鼠胰腺组织PCNA表达降低(P<0.05)(图1C)。

A.HE staining of pancreatic tissue of db/m and db/db mice, scale bar=50 μm; B.immunofluorescence staining of islet of db/m and db/db mice, scale bar=100 μm; C.PCNA protein expression was detected by Western blot; *P<0.01 compared with db/m group

2.2 db/db鼠血清GLP-1水平降低，胰岛GLP-1R水平降低

db/db鼠血清中GLP-1的水平明显降低(图2A)(P<0.05)。db/db鼠胰腺组织内GLP-1R蛋白水平低于db/m鼠(图2B)(P<0.05)。db/db鼠胰岛内GLP-1R水平显著低于db/m鼠(图2C)。

2.3 db/db鼠胰腺组织TXNIP表达升高

与对照组db/m鼠相比，db/db鼠胰腺组织中TXNIP的蛋白表达显著升高(P<0.05)(图3)。

2.4 TXNIP过表达细胞模型构建成功

用慢病毒转染MIN6小鼠胰岛细胞，构建TXNIP过表达稳转细胞系。荧光显微镜观察，发现GFP高表达，慢病毒转染成功(图4A)。Ad-TXNIP-GFP组TXNIP的表达明显高于对照组和Ad-GFP组(图4B)(P<0.05)。

2.5 TXNIP过表达引起胰岛β细胞的GLP-1R水平降低

Ad-TXNIP-GFP组GLP-1R蛋白水平明显低于对照组和Ad-GFP组(图5A)(P<0.05)。细胞免疫荧光结果与其一致(图5B)。

A.GLP-1 levels were detected in serum by ELISA; B.GLP-1R protein expression was detected by Western blot, *P<0.05 compared with db/m group; C.GLP-1R protein expression was detected by immunohistochemical staining, scale bar=100 μm

TXNIP protein expression was detected by Western blot; *P<0.05 compared with db/m group图3 db/db小鼠胰腺组织TXNIP表达升高Fig 3 TXNIP expression was increased in pancreatictissue of db/db n=6)

2.6 TXNIP过表达使GLP-1对胰岛β细胞的增殖效应降低

与Ad-GFP组相比，Ad-TXNIP-GFP组细胞PCNA蛋白表达明显降低(P<0.05)，Ad-GFP+liraglutide组PCNA蛋白表达升高(P<0.05)，但与Ad-GFP+liraglutide组相比，Ad-TXNIP-GFP+liraglutide组PCNA蛋白水平明显下降(P<0.05)(图6A)。增殖相关指标Ki67与PCNA变化一致(图6B)。

3 讨论

糖尿病的发病机制包括胰岛β细胞的功能恶化[1]、凋亡增加及增殖减弱。因此，抑制胰岛β细胞数量减少，促进其增殖有望成为治疗糖尿病的靶点之一。

A.fluorescence microscopy observates of GFP expression, scale bar=100 μm; B.TXNIP protein expression was detected by Western blot; *P<0.05 compared with Ad-GFP group

A.GLP-1R protein expression was detected by Western blot; *P< 0.05 compared with Ad-GFP; B.representative images show the expression level of GLP-1R (red) and DAPI (blue), scale bar=100 μm

大量研究表明，GLP-1能显著促进胰岛β细胞的增殖[10]。本课题发现db/db鼠中GLP-1和GLP-1R的表达均低于db/m鼠，进一步研究发现TXNIP的表达升高[6]，db/db鼠胰岛结构破坏，β细胞数量减少，胰腺组织增殖降低，但其机制尚不明确。研究发现，硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interact-ing protein，TXNIP)能抑制肿瘤细胞[7]的增殖。而GLP-1激动剂能下调TXNIP的表达[11]，那么TXNIP可能会对GLP-1促增殖作用的发挥产生影响。此外，TXNIP具有下调某些核转录因子如Mafa、STAT3[8]等的能力，故本研究推测其可能会影响胰岛β细胞GLP-1R的表达。

A.PCNA protein expression was detected by Western blot, *P<0.05 compared with Ad-GFP, #P<0.05 compared with Ad-TXNIP-GFP group, △P<0.05 compared with Ad-GFP +liraglutide group; B.the expression level of Ki67 (red) and DAPI (blue) was detected by fluorescence microscope, scale bar=100 μm

为此，本课题用慢病毒转染小鼠胰岛β细胞系，TXNIP过表达稳转细胞株构建成功。在此基础上，本研究检测了GLP-1R的表达，发现TXNIP过表达时细胞的GLP-1R水平降低，提示TXNIP可以下调GLP-1R的表达。

除PCNA外，Ki67作为存在于增殖细胞中的核抗原，也被用作细胞增殖的标记。因此，本研究检测PCNA和Ki67的表达，发现TXNIP过表达时PCNA和Ki67表达均降低，提示TXNIP可抑制胰岛β细胞增殖。为进一步探究TXNIP能否影响GLP-1对胰岛β细胞的增殖效应，给予GLP-1受体激动剂利拉鲁肽干预，发现TXNIP过表达可使GLP-1对胰岛β细胞的增殖效应降低。

综上所述，db/db鼠中TXNIP表达升高能降低胰岛β细胞上GLP-1R的表达，进而降低GLP-1对胰岛β细胞的增殖效应。该结果有望为糖尿病的治疗提供新靶点。