竹叶黄酮提取物对HepG2 细胞氧化应激的调节作用
2020-08-10张守丽陆梦琪刘俊慧俞玥董燕军
张守丽，陆梦琪，刘俊慧，俞玥*，董燕军
（1.湖州职业技术学院，浙江湖州 313000；2.江苏科技大学粮食学院，江苏镇江 212004；3.浙江工业职业技术学院，浙江绍兴 312000）
现代生活的高能量密度膳食结构中脂肪摄入过多，致使体内能量代谢旺盛，细胞代谢副产物活性氧（Reactive oxygen species，ROS）增加可诱发机体氧化应激，严重威胁人类健康[1-4]。现有研究表明，植物来源的天然抗氧化物质能够有效干预氧化应激，减少有害副产物ROS 的产生，对于抑制氧化应激损伤及其相关疾病的预防具有重要意义[5-6]。
植物黄酮类是最基本的植物天然抗氧化剂。黄酮类膳食补充剂的摄入有助于维持和促进人体生理健康[7-9]。谷物黄酮和豆科黄酮醇处理细胞，可以对由脂质体刺激引起的细胞炎症产生协同抗炎反应[10]。Barreca 等[11-13]的研究也证实柑橘汁（Citrus sinensis
目前，竹叶黄酮提取物作为食品添加剂得到了大量关注，然而，其对高脂膳食引起的机体氧化应激干预作用的相关报道较少，亟需开展相关研究以揭示竹叶黄酮提取物对高脂膳食引起的细胞氧化应激状态的影响，为相关功能食品的开发及利用提供理论支持。本项目在前期研究的基础上，构建了油酸损伤HepG2 细胞模型，以富含黄酮化合物的竹叶粗提物为干预材料，通过测定干预前后甘油三酯（TG）、乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）的含量，并利用流式细胞技术探究竹叶黄酮粗提物对油酸诱导的细胞ROS 水平升高的缓解作用，研究竹叶黄酮提取物对油酸引起的细胞损伤的作用。
1 材料与方法
1.1 试剂及仪器
1.1.1 材料与试剂
HepG2 细胞株购于上海生物化学与细胞生物学研究所。胎牛血清培养基及0.25%胰蛋白酶购于Gibco 公司（Hyclone，Logan，UT，USA）；儿茶素、MTT 试剂与油酸购自Sigma 公司，细胞培养皿购于上海生工生物有限公司；竹叶黄酮粗提物，浙江圣氏生物科技有限公司（湖州）；DCFH-DA 细胞ROS 测试试剂盒，S0033，上海碧云天生物科技有限公司；甘油三酯（TG）、乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）试剂盒，购于南京建成生物工程有限公司（南京）；其他试剂均为分析纯。
1.1.2 仪器与设备
美国Eppendorf 离心机、生物安全柜、移液器；日本Sanyo MCO-15AC CO2恒温培养箱；日本Olympus IX51倒置显微镜；美国Bioteck Synergy H2 多功能酶标仪等。
1.2 细胞复苏与培养
参照Huang 等[19]的细胞培养方法略做修改。液氮中的HepG2 细胞经37 ℃温育解冻，转移到5 mL 的离心管中，室温1200 r/min 离心3 min 并弃上清，用完全培养基（含10%胎牛血清+1%双抗）悬浮细胞后接种到培养皿中，轻轻吹打混匀，饱和湿度条件下培养（37 ℃、5%CO2）。经传代后取对数期的细胞进行后续试验。
1.3 油酸模型的确立
试验设置对照组、无细胞空白组、0.1 mmol/L 油酸干预组、0.2 mmol/L 油酸干预组、0.4 mmol/L 油酸干预组5个处理，对数期的细胞培养12、24、36 h 后，经MTT 测试细胞的存活率后，采用试剂盒测试细胞TG、LDH 含量，以确定油酸模型的油酸处理浓度及培养时间。
1.4 试验设计
复苏后处于对数生长期的HepG2 细胞经胰酶消化后，用培养基调整细胞密度至5×104mL-1，并接种到96微孔板，采用不同培养液培养不同时间后测试其生化指标。试验设置对照组、无细胞对照组、油酸处理组、竹叶黄酮干预组。
油酸24 h 组：按照0.1、0.2、0.4 mmol/L 的浓度将油酸加到微孔板中，培养24 h。
油酸12 h+正常12 h 组：按照0.1、0.2、0.4 mmol/L 的浓度将油酸加到微孔板中，培养12 h；除去油酸后，再加入细胞培养液继续培养12 h。
油酸12 h+竹叶黄酮12 h 组：按照0.1、0.2、0.4 mmol/L的浓度将油酸加到微孔板中，每孔加入120 μg/mL 的竹叶黄酮提取物进行培养。每组重复3 次。
对照组为细胞培养24 h（不添加油酸和竹叶黄酮提取物），无细胞空白组只添加培养液，测试时作为背景予以扣除。
1.5 MTT 测试
细胞培养12、24、36 h 后，每孔加入10 μL 的MTT溶液，37 ℃培养4 h 并去掉培养基后，加入DMSO 溶液振荡10 min，利用酶标仪测定570 nm 处的吸光度值。
1.6 生化指标的测试
LDH 可以催化乳酸生成丙酮酸的反应，且可以透过损伤的细胞膜进入培养液，因此细胞培养液中LDH 的含量越高，表明细胞发生的氧化损伤越严重[20]。TG 含量是细胞出现脂肪肝损伤的重要指标[21]。MDA 含量被认为是细胞是否发生脂质过氧化的一个重要指标[22]。LDH 采用2,4-二硝基苯肼法测试，TG 采用甘油磷酸氧化酶法（GPO-PAP 法）测试，MDA 采用硫代巴比妥酸法测试，具体测试步骤参考试剂盒的说明书执行。
1.7 流式细胞仪测试ROS 水平
根据1.3 油酸模型结果，确认油酸损伤模型的油酸浓度、培养时间，以及竹叶黄酮提取物的干预浓度后，设置不同的试验组进行细胞培养。培养结束后，用0.25%的胰酶溶液消化细胞，1200 r/min 离心3 min 后，沉淀复悬于PBS 溶液进行2～3 次清洗。活性氧的检测按照DCFH-DA 细胞ROS 测试试剂盒的操作说明进行，即在去除PBS 后，用无血清培养基稀释DCFH-DA，阴性对照加不含DCFH-DA 探针的培养基溶液。37 ℃温育20 min，中间5 min 涡旋一次。温育结束后，经无血清的培养基洗涤细胞2～3 次后，利用流式细胞仪进行检测。
1.8 统计分析
应用SPSS19.0 统计软件进行数据处理，采用Oneway ANOVA 程序进行单因素方差分析。结果以“平均值±标准差”的形式表示，P<0.05 为差异显著。
2 结果与分析
2.1 油酸模型的建立
利用不同浓度的油酸进行细胞培养后，采用MTT 法测试细胞的存活情况，结果如图1 所示。结果显示，采用0.1、0.2、0.4 mmol/L 三个浓度的油酸分别培养HepG2 细胞12、24、36 h 后，与对照组比较发现，0.1 mmol/L 的油酸与对照组在处理时间里不存在显著差异（P>0.05）。0.2 mmol/L 油酸干预组培养12 h 和24 h 时，细胞的存活率下降，但不显著；在培养36 h 时，细胞的存活率显著下降，与对照组存在显著性差异（P<0.05）。而采用0.4 mmol/L 油酸干预时，培养12 h 就对细胞的存活率产生了显著的影响。
结合TG 和LDH 的含量变化（图2，见下页）发现，在使用油酸培养HepG2 细胞时，与对照组相比，不同浓度的油酸（0.1、0.2、0.4 mmol/L）均可对细胞的TG 及LDH水平产生显著的影响（P<0.05），可以用于油酸模型的构建。结合油酸对细胞存活率影响的MTT 试验结果，油酸模型的浓度定义为0.2 mmol/L 且培养时间为24 h。同时，根据前期研究结果显示，120 μg/mL 的竹叶黄酮提取物（总黄酮含量为78.29±0.31 mg/g 干物质，以儿茶素计）不对细胞的存活率产生显著影响（P>0.05），后续干预试验采用此浓度进行氧化应激的干预研究。
2.2 不同处理对HepG2 细胞TG 水平的影响
研究显示，高脂膳食地摄入可以使细胞内TG 含量大量积累，导致肝损伤[23]。也有研究表明，油酸可以通过诱导线粒体功能障碍加剧氧化损伤[24]。在本试验中，不同处理对HepG2 细胞TG 水平的影响见图3，由图3 可知，油酸培养导致HepG2 细胞出现严重的TG 积累，达到0.92 mmol/L。相比于油酸24 h 组，油酸12 h+竹叶黄酮12 h 组的TG 含量为0.58 mmol/L，出现显著下降（P<0.05），下降了37%；同时显著低于油酸12 h+正常12 h组TG 水平（P<0.05）。结果表明，竹叶黄酮提取物干预可以有效地降低HepG2 的TG 水平，有助于减轻油酸对HepG2 细胞的氧化损伤。
2.3 不同处理对HepG2 细胞LDH 水平的影响
不同处理对HepG2 细胞LDH 水平的影响如图4 所示，由图可知，油酸培养导致HepG2 细胞出现严重的LDH 积累，远远高于对照组的LDH 含量。相较于油酸24 h 组，油酸12 h+竹叶黄酮12 h 组的LDH 含量为110.5 U/L，出现显著下降（P<0.05），下降了34%；同时显著低于油酸12 h+正常12 h 组的LDH 水平（P<0.05）。结果表明，油酸诱导的细胞培养液中LDH 的含量升高，表明细胞处于氧化应激状态，竹叶黄酮提取物的干预可以有效地降低HepG2 的LDH 水平，有助于减轻HepG2 细胞的氧化损伤。
2.4 不同处理对HepG2 细胞MDA 含量的影响
MDA 是细胞内自由基与脂质作用发生脂质过氧化后的终产物，可以对蛋白质和核酸产生影响，具有一定的生理毒性[25]。如图5 所示，随着培养时间的延长，油酸24 h组的细胞MDA 水平出现显著增加，远大于其他处理组（P<0.05）。油酸12 h+正常12 h 组较之于油酸24 h 组，MDA水平出现显著回落。油酸12 h+竹叶黄酮12 h 组细胞的MDA 水平显著降低，与油酸12 h+正常12 h 组、油酸24 h组相比，分别降低了19%和49%。细胞的MDA 水平在油酸诱导前后及竹叶黄酮提取物干预前后的变化显示，油酸诱导可以显著提升细胞内的脂质过氧化反应，导致细胞损伤，而竹叶黄酮提取物的干预则可以有效地降低脂质过氧化水平，减轻由油酸带来的氧化应激，有助于维持细胞的健康状态。
2.5 流式细胞仪测试ROS 水平
采用流式细胞仪并使用DCFH-DA 探针检测ROS的含量水平如图6 所示，由图可知，油酸24 h 组ROS 水平显著高于对照组（P<0.05）。相较于油酸24 h 组的HepG2 细胞，油酸12 h+正常12 h 组可以显著地降低ROS 水平（P<0.05）；油酸12 h+竹叶黄酮12 h 组的ROS水平也显著下降（32%），且显著低于油酸12 h+正常12 h组。结果表明，竹叶黄酮提取物有效地减轻了油酸诱导导致的HepG2 细胞ROS 水平升高。细胞上清TG 含量的变化与细胞ROS 水平的变化共同揭示了油酸对HepG2的氧化损伤作用，并证实了竹叶黄酮提取物可以有效的削弱或者减轻这种氧化损伤。
现有研究表明，细胞内的ROS 水平与多种信号通路的调控有关[26-27]。同时，细胞内部的ROS 水平也是评价细胞损伤是否发生的重要信号[28]。ROS 的稳定来自于ROS的产生与清除之间的动态平衡，本研究显示，竹叶黄酮提取物干预后，细胞的ROS 水平显著下降（P<0.05），有利于维持细胞内正常的ROS 水平，维持细胞的正常生理稳态，也有助于减轻油酸诱导导致的ROS 水平的过度升高。经竹叶黄酮干预后，细胞的ROS 水平并没有下降到对照组的水平，而是略高于对照组，这也表明，适度升高的ROS 水平，也有助于提升细胞的抗氧化应答，促使细胞产生更多的抗氧化物质，使其快速恢复正常稳态[27]。
3 结论
机体内的自由基含量过多时可以引起氧化损伤，使细胞处于氧化应激状态。天然植物有效成分可以有效清除体内自由基，维持机体正常的生理活性。本文构建了油酸诱导HepG2 细胞的氧化损伤模型，探究了竹叶黄酮提取物对油酸诱导氧化损伤细胞的干预水平。通过试验得出，相较于对照组，竹叶黄酮提取物可以有效地降低细胞的TG、LDH、MDA、ROS 水平，这表明油酸能够诱导细胞处于氧化应激状态，且竹叶黄酮提取物对细胞氧化应激状态有良好的改善作用。本项目中竹叶黄酮提取物对细胞氧化损伤的干预作用研究有助于拓宽相关功能产品的开发及综合利用。
