缢蛏养殖池塘氨氧化微生物的季节变化特征

王鑫毅 赵 婧 金 珊 赵青松 周素明 竺俊全

(1.宁波大学海洋学院,宁波 315832;2.宁波大学高等技术研究院,宁波 315211)

近年来,随着缢蛏(Sinonovacula constricta)养殖的不断发展,高密度集约化的养殖方式使得缢蛏养殖过程中经常出现缢蛏生长速度慢,活力低下甚至频发不明原因死亡的现象,而养殖水体环境的恶化是造成以上情况的主要原因[1],其中氨氮污染是水产养殖中的最直接、最重要的胁迫因子[2]。养殖环境中过高的氨氮会造成水生动物的毒害作用,导致免疫力下降,增加感染疾病的风险[2,3]。据报道,养殖环境中的氮素主要来源于饲料及养殖生物的排泄物,Hargreaves等[4]的研究表明,大约只有30%左右的饲料氮素被养殖生物利用,而70%左右的饲料氮素被排放到养殖环境中;Jackson等[5]对虾类养殖过程进行了监测,结果显示投入的饲料氮只有22%转化为虾生物量,而14%沉积在底泥,54%被排放到水环境中;高攀等[6]对草鱼的养殖研究也认为只有占总氮35.4%—37.9%的氮素是以鱼体的形式产出。因此,如何解决氮素污染是目前水产养殖绿色发展面临的关键问题。

自然界对氮素污染物的自净能力主要取决于氮素转化微生物的作用,而硝化作用是自然界氮素循环的核心环节,也是氨氮脱除过程中至为重要的一步,其包括氨氧化作用以及亚硝化作用[7]。氨氧化作用是硝化作用的第一步,也被认为是硝化作用的限速步骤,主要由氨氧化细菌(Ammonia-oxidizing bacterial,AOB)和氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea,AOA)进行驱动[8]。已有的研究表明,AOA和AOB的氨氧化作用主要是由其体内的氨单加氧酶(Ammonia monooxygenase,AMO)催化的,而amoA基因编码了AMO其中一个亚基[9],由于amoA基因具有较强的保守性,且已被证实在AOA和AOB中均含有amoA基因[10,11],因此,现今amoA基因已成为AOA和AOB的主要分子标记之一[7]。目前,对于AOA和AOB的研究主要集中于湖泊沉积物[12—14]、土壤[15,16]等环境中,而关于水产养殖环境的相关报道较少,主要有南美白对虾(Penaeus vanname)[17]、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)[18]及太湖中鱼虾蟹混养区[19]等水产动物养殖环境中AOA和AOB的相关分析,且已有的研究基本也是针对淡水养殖环境的。因此,为了进一步明确海水养殖环境中氨氧化微生物的动态变化及与养殖动物的相关性,本研究利用荧光定量PCR技术对缢蛏养殖池塘水体和沉积物中AOA和AOB的amoA基因进行了定量分析,探讨缢蛏养殖过程中氨氧化微生物的季节动态变化及环境因子相关性,以期为养殖过程中氮素循环的有效管理及水质调控技术的研发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

试验用水样、泥样及缢蛏均来自宁波市宁海县长街镇合成村(29.21N,121.7E)养殖状况良好的缢蛏养殖塘(153 m×62 m),塘深约1 m,养殖塘于2018年4月4日放养来自三门县的甬乐一号苗200 kg,8000粒/kg。试验于2018年4月(春季)、7月(夏季)、10月(秋季)、2019年1月(冬季)利用5点采样法采集样品,每个点使用2.5 L有机玻璃采水器采取养殖水体中上层距离水面约40 cm处水样[20],再将5个点的水样均匀混合作为每个月的试验用水样;泥样也分为相同的5个点,将每个点取得的泥样均匀混合后作为每个月试验用泥样,每种样本按相同的方法采三次作为试验平行,将所采样品于4℃保存,所有样品的DNA提取在24h内完成。

1.2 养殖池塘水质指标测定

温度、溶解氧、pH采用YSI 556水质检测仪测定,透明度利用透明度盘测定,盐度利用盐度计测定,其余水质因子依据海洋监测规范(GB17378.4—2007)进行测定,过硫酸钾氧化法测定总氮(TN)和总磷(TP),次溴酸钠氧化法测定氨氮(NH),锌镉还原法测定硝态氮(NO),盐酸萘乙二胺测定亚硝酸盐氮(NO),磷钼蓝法测定活性磷(PO),高锰酸钾氧化法测定化学需氧量(COD)。

1.3 样品DNA提取

水样每组平行100 mL水用0.22 μm的无菌纤维素滤膜过滤,过滤后的滤膜剪碎,用于DNA提取;沉积物样每个平行取500 mg。各样品都利用Fast DNA Spin Kit for Soil试剂盒(MPbio,USA)按照试剂盒说明书提取总DNA,经Nano Drop 2000蛋白质核酸分析仪(ThermoFisher,USA)测定提取出的DNA浓度和纯度后,将DNA样品于-20℃中保存,用于后续分析。

1.4 绝对定量标准曲线的制作

将提取的水样及沉积物样的DNA作为PCR扩增模板,AOBamoA基因扩增引物为bamoA1F(5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′)和bamoA2R(5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′)[21],AOAamoA基因扩增引物为amoAF(5′-STAATGGTCTG GCTTAGACG-3′)和R(5′-GCGGCCATCCATCT GTATGT-3′)[21],扩增体系为2×TaqMasterMix(康为世纪)25 μL,正反向引物浓度为10 μmol/L各2 μL,DNA模板2 μL,加ddH2O补足至50 μL。PCR扩增程序如下: AOB: 94℃,2min;(94℃,30s;55℃,30s;72℃,30s)×35;72℃,2min;AOA: 94℃,2min;(94℃,30s;53℃,30s;72℃,30s)×35;72℃,2min。使用Gel Extraction Kit (OMEGA) 切胶回收试剂盒对PCR产物进行回收,回收产物与pMD18-T载体连接后转入DH5α 感受态细胞中,进行蓝白斑筛选。选取白色克隆后利用菌落PCR进行阳性克隆鉴定,载体引物为M13F和M13R,将挑取出的白色克隆进行测序,与NCBI比对,AOB与亚硝化单胞菌(KU365739.1)amoA基因同源性99%,AOA与泉古菌(JQ345856.1)amoA基因同源性99%,因此可作为绝对定量标准品。利用Plasmid Mini Kit (OMEGA)提取重组质粒,经Nano Drop 2000蛋白质核酸分析仪测定DNA浓度,AOB重组质粒DNA浓度为80.09 ng/μL,AOA重组质粒DNA浓度为452.02 ng/μL。根据阿伏伽德罗常数计算amoA基因拷贝数,AOB为2.30×1010copies/μL,AOA为1.24×1011copies/μL,将AOA及AOB重组质粒DNA以10倍浓度稀释6个梯度,用于标准曲线的绘制。

1.5 amoA基因荧光定量PCR

采用Roche LighterCycler®480 Ⅱ荧光定量PCR扩增仪进行定量,扩增体系为: 2×Trans Start Tip Green qPCRSuper Mix(全式金) 10 μL,浓度为10 μmol/L的AOA、AOB正反向引物各0.4 μL,DNA模板1 μL,用dd H2O补足至20 μL。反应程序如下: AOB:94℃,30s;(94℃,5s;55℃,15s;72℃,10s)×40;AOA: 94℃,30s;(94℃,5s;53℃,15s;72℃,10s)×40。每个样品设置三个平行。

1.6 数据处理

利用SPSS 20.0进行数据分析,利用单因素方差分析(One way ANOVA)比较水质因子、AOB和AOA丰度的季节变化的显著性,利用Pearson相关系数法分析丰度与水环境因子的相关性,利用多元线性回归方程做环境因子与氨氧化微生物丰度的回归分析。

2 结果

2.1 不同季节缢蛏养殖池塘水质指标

如表1所示,季节变化对于池塘水质理化因子有一定的影响,四季的水温、硝氮、亚硝氮及透明度均呈显著差异(P＜0.05);冬季溶氧和总氮含量显著高于其他季(P＜0.05),而春夏季无显著差异(P＞0.05);春季总磷最低,且显著低于夏秋季(P＜0.05),与冬季无显著差异(P＞0.05);活性磷在春季显著高于其余三季(P＜0.05),夏秋季无显著差异(P＞0.05);氨氮浓度在秋季最高,显著高于冬夏两季(P＜0.05);夏季化学需氧量显著高于其余三季(P＜0.05)。

2.2 不同季节AOB和AOA的 amoA基因丰度变化

如图1所示,在水体中,四个季节AOB的amoA基因拷贝数变化范围在(1.82—5.13)×104copies/mL,其中秋季最高且显著高于其余三季(P＜0.05),其余三季之间无明显差异(P＞0.05);AOA的amoA基因拷贝数变化范围为(5.65—6.73)×105copies/mL,冬季为最低值且与春秋两季有显著差异(P＜0.05)。在沉积物中,四个季节的AOB的amoA基因拷贝数变化范围在(1.45—8.35)×107copies/g,最高值在冬季且显著高于其余三季(P＜0.05),春夏秋季含量无明显差异(P＞0.05);AOA的amoA基因拷贝数变化范围在(2.546.04)×108copies/g,最高值在冬季且显著高于其余三季(P＜0.05),春夏秋季含量无明显差异(P＞0.05)。

表 1 不同季节缢蛏养殖池塘水质指标Tab.1 Water quality index of Sinonovacula sinensis pond in different seasons

从图2中可以看出在缢蛏养殖池塘水体及沉积物中的AOA的数量均比AOB的数量高一个数量级,在夏季水体中比值达到最高,且与秋冬季呈显著差异(P＜0.05),而在沉积物中秋季比值达到最高,与冬季呈显著差异(P＜0.05)。

2.3 水体及沉积物中AOB和AOA丰度与水环境因子的相关性

如表2所示,在水中,AOB丰度与酸碱度(r=−0.722,P=0.008)、氨氮(r=0.698,P=0.012)呈显著正相关,与亚硝氮(r= -0.589,P=0.044)、透明度(r=0.728,P=0.007)呈显著负相关,与水温、溶解氧、总磷、活性磷、总氮、硝氮和化学需氧量相关性不显著(P＞0.05);AOA丰度与水温(r=0.631,P=0.028)呈正显著相关,与硝氮(r=-0.720,P=0.008)呈负显著相关,与溶解氧、酸碱度、总磷、活性磷、总氮、氨氮、亚硝氮、化学需氧量及透明度呈不显著相关(P＞0.05)。在沉积物中,AOB丰度与溶解氧(r=0.742,P=0.006)、硝氮(r=0.938,P=0.000)、总氮(r=0.655,P=0.021)及亚硝氮(r=0.577,P=0.050)呈显著正相关,与水温(r=-0.885,P=0.000)呈显著负相关,与酸碱度、总磷、活性磷、氨氮、化学需氧量及透明度呈不显著相关(P＞0.0 5);A O A 丰度与溶解氧(r=0.7 2 9,P=0.007)、总氮(r=0.676,P=0.016)、硝氮(r=0.895,P=0.000)呈显著性正相关,与水温(r= -0.863,P=0.000)、活性磷(r= -0.587,P=0.045)呈负显著相关,与酸碱度、总磷、氨氮、亚硝氮、化学需氧量及透明度呈不显著相关(P＞0.05)。

通过将水体中AOA和AOB、沉积物中AOA和AOB的丰度作为因变量,水环境因子作为自变量进行多元逐步回归分析。由表3可知,硝氮、透明度、化学需氧量和总磷有入选回归方程,其中水体中AOA丰度的回归方程水质因子中有硝氮入选;水体中AOB丰度的回归方程中有透明度和化学需氧量两个水质因子入选;沉积物中AOA丰度的回归方程有硝氮及总磷两个水质因子入选;沉积物中AOB丰度的回归方程只有硝氮入选。其中硝氮入选了3个方程,说明硝氮与缢蛏养殖池塘中氨氧化微生物丰度密切相关。

3 讨论

3.1 缢蛏养殖池塘AOA和AOB的丰度

已有的研究表明,氨氧化微生物广泛分布于淡水和海水水域及自然界的土壤系统中,由于这两类细菌的生理生化等特性的差别,从而使得它们在不同的环境中存在着不同的生态位分化[22]。本文利用实时荧光定量PCR技术对不同季节缢蛏养殖池塘水体及沉积物中的AOA和AOB的丰度进行了研究,结果发现在不同季节缢蛏养殖池塘环境中AOA丰度均比AOB丰度高一个数量级,在数量上占据绝对优势,这与高利海等对南美白对虾养殖塘底泥[23]和Wuchter等[24]和Mincer等[25]对海洋环境的研究结果一致,而与Wu等[26]对太湖湖湾养鱼区及Lu等[27]对湖北崇湖渔场的研究结果不同。作者认为这可能是AOA和AOB对海淡水环境的适应性不同所导致,由于AOA拥有比AOB更宽的生态位[28],使得AOA更能适应贫营养、厌氧、高盐度等复杂的生态环境,因此,在缢蛏养殖池塘环境的氨氧化作用中AOA起着主导地位,而盐度也是影响养殖池塘氨氧化微生物菌群结构的一个重要的因素,随着养殖环境盐度的上升,AOA的相对丰度会升高[29]。

图1 水体和沉积物中AOB和AOA丰度的季节变化Fig.1 Seasonal abundance of the AOB and AOA in water and sediments

图2 不同季节水体和沉积物中AOA与AOB的丰度比值变化Fig.2 Abundance ratio of AOA and AOB in water and sediments in different seasons

3.2 缢蛏养殖池塘AOA和AOB的季节动态变化与水环境因子的相关性

本研究结果表明,缢蛏养殖池塘水体及沉积物中的AOA和AOB丰度呈现一定的季节性波动,水中的AOB及AOA丰度均在秋季最高,且AOB显著高于其余三季(P＜0.05),沉积物中的AOB及AOA均在冬季显著高于其余三季(P＜0.05),而其余季节间无明显差异。环境因子相关性分析显示,水温是影响缢蛏养殖池塘氨氧化微生物丰度的重要因素之一,水体中AOB与水温呈负相关但不显著(P＞0.05),AOA与水温呈正显著相关(P＜0.05),而沉积物中AOA和AOB与水温呈显著负相关(P＜0.05),这与潘彦宇等[12]、覃雅等[18]的研究结果相似。作者认为由于目前已知的AOB大多是属于中温类菌群,适合在40℃以下生长,最适生长温度为20—30℃,而AOA对温度的响应范围要比AOB更广,其对高温环境和低温环境的适应性高于AOB[30,31]。

此外,随着养殖进程的推进,由于投饵、施肥及缢蛏等生物的粪便产生,使得养殖底泥中含氮物质不断积累,而AOB和AOA是自然界氨氮物质硝化作用的推动者,因此沉积物中总氮、硝氮及亚硝氮均在冬季达到最高且显著高于其余三季(P＜0.05),而本研究的结果表明,氨氮、亚硝氮及硝氮的浓度也在一定程度上影响着缢蛏养殖池塘氨氧化微生物的丰度。已有的研究表明,在一定范围内氨氮含量的增加会促进氨氧化反应和氨氧化微生物的生长,但高水平的氨会抑制AOA的生长[32,33],Yasuda等[34]的研究发现AOA丰度与某些特异性游离氨浓度成正比,Limpiyakorn等[35]的实验显示AOA的氨氮半饱和浓度范围在0.001—0.01 mg/L,而AOB的半饱和浓度则比AOA高1—4个数量级。而本研究检测四季水体中氨氮浓度均小于1 mg/L,因此这可能也是缢蛏养殖池塘中AOA占主导地位的原因之一。

缢蛏养殖过程中养殖池塘与外界水体交换相对较少,当养殖密度过高或投饵量过大的时候,水体溶解氧会被大量消耗。而氨氧化过程是以氧气作为反应基质,因此氧气的浓度从某种意义上决定了AOA和AOB种类的分布[36]。在本研究中,沉积物中的AOA和AOB丰度均与溶解氧成显著正相关(P＜0.05),且AOA在低氧浓度下更具生长优势,这与印度池塘养殖沉积物[37]、美国湖泊沉积物[38]、黄东海泥质区[39]中的研究结果相类似,当溶解氧降低的时候养殖环境中的氨氧化过程会受到影响。另外,多元回归方程和相关性结果也显示,总磷、化学需氧量等其他环境因子对AOA和AOB的丰度也有一定的影响。

综上所述,缢蛏养殖池塘中AOA及AOB的生长受到盐度、温度、氨氮浓度及溶解氧等多种环境因子的共同影响,由于AOA和AOB在自然界氮循环中有着重要的作用,尤其是AOA可能占据着缢蛏养殖塘氨氧化进程的主导地位。因此,在缢蛏养殖过程中需要加强水质指标的监控,尤其是含氮营养盐指标,控制好养殖密度、投饵量及废弃物的排放,适当投喂微生物等环境改良剂,防止水体富营养化,确保养殖过程中氮循环的稳定性,注重水产养殖与环境的可持续发展,提高缢蛏养殖产量。

表 2 水体及沉积物中AOB和AOA丰度与水环境因子的Pearson相关系数Tab.2 Pearson correlation coefficient of AOB and AOA abundance with water environmental parameters in water and sediments

表 3 缢蛏养殖池塘氨氧化微生物丰度与水环境因子的多元逐步回归方程Tab.3 Stepwise multiple regression equation of ammoniaoxidized microbial abundance and water environment factors in Sinonovacula constricta pond