圆口铜鱼亲本与子代肝脏转录组特征及对比分析

李学梅 吴兴兵 龚进铃 朱永久 杨德国

(中国水产科学研究院长江水产研究所,农业农村部淡水生物多样性保护重点实验室,武汉 430223)

圆口铜鱼(Coreius guichenoti)隶属于鲤形目(Cypriniformes)、亚科 (Gobioninae)、铜鱼属(Coreius),主要分布于金沙江中下游、长江上游干流等水域,曾是长江上游地区特有的经济鱼类和主要捕捞对象[1]。近年来,由于金沙江中下游梯级电站的大力开发、长期的过度捕捞和环境污染等问题,圆口铜鱼产卵场遭到破坏,洄游通道被阻断,其种群资源呈现急剧下降趋势,严重威胁到该物种的生存与延续[2]。因此,加强圆口铜鱼种群资源的保护和恢复工作已显得极为迫切。目前,增殖放流被认为是水生生物资源养护和水域生态保护的主要途径,也是保护珍稀濒危鱼类的有效措施之一[3,4],而增殖放流的前提是驯养足够的亲鱼,进行人工繁殖[5]。然而,由于圆口铜鱼应激反应激烈,人工养殖时极易感染小瓜虫,死亡率较高,人工驯养亲鱼难度较大且目前圆口铜鱼的应激机制尚未可知。

转录组学技术是伴随着后基因组学发展起来的新兴科学[6],是利用高通量测序对特定组织或细胞中所有RNA反转录而成的cDNA文库进行测序,查找物种特异性状的潜在主效基因和差异基因物种特异性状的潜在主效基因和差异基因、研究基因表达调控[7]。该技术已经成为研究生物生长发育、应激机理、免疫防御等机制的主要工具[8]。肝脏是鱼类最大的消化腺,也是最重要的代谢器官之一,物质代谢能力旺盛,在机体中具有免疫防御、解毒、激素分泌和合成等功能[9]。应用转录组技术已对大西洋鲑(Salmo salar)[10]、乌鳢(Channa argus)和斑鳢(Channa maculata)[11]、白鲢(Hypophthalmichthys molitrix)[12]、花鲈(Lateolabrax maculatus)[13]等多种鱼类肝脏免疫反应进行研究。

本研究对圆口铜鱼亲本和子代肝脏的转录组进行测序,分析其转录组特征和差异表达基因并探讨其功能,在丰富圆口铜鱼基因组数据的同时,为圆口铜鱼应激反应的分子机制研究以及分子标记的开发和利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验对象

试验用鱼来自中国水产科学院长江水产研究所循环水养殖系统,2017年9月在养殖桶里随机捞取3 尾圆口铜鱼亲本(简称圆亲YQ)和3尾圆口铜鱼子代(简称圆子YZ),体长、体重见表1。圆口铜鱼亲本在养殖系统养殖超过4年且多次感染小瓜虫并治愈,而子代为2016年6月人工繁殖获得,截止到采样日期未感染小瓜虫。将鱼麻醉后,在低温条件下解剖取肝脏组织,经液氮冷冻后,保存于-80 ℃备用。

表 1 亲本与子代圆口铜鱼体长体重 (平均值±标准差)Tab.1 The body length and body weight of Coreius guichenoti in different groups (Mean±SD)

1.2 RNA 提取、文库构建

将肝脏组织置于液氮预冷的研钵中,研磨至粉末状,之后使用RNA Purification Reagent(Invitrogen)试剂盒对肝脏组织总RNA进行抽提,然后通过TruseqTMRNA sample prep Kit(Illumina)试剂盒建库。转录组的测序工作由上海凌恩生物科技有限公司完成。

1.3 转录组组装

原始数据需经过过滤来控制序列的质量,过滤原则主要包括: (1) 去除reads中的接头序列,去除因接头自连导致没有插入片段的reads;(2) 将序列末端(3′端)质量值小于20的碱基修剪掉,如果剩余序列中仍存在质量值小于10的碱基,则将整条序列剔除;(3) 将含N比率超过10%的reads去除;(4) 舍弃去adapter及质量修剪后长度小于70 bp的序列。同时计算 Q20、Q30含量和重复序列水平,后续分析均在清洁数据基础上进行。所获得的数据利用 Trinity 软件进行拼接。

1.4 基因功能注释

对拼接得到的unigene序列进行注释,并与Nr、string、gene数据库比对,通过比对,将得到的序列与 NCBI数据库(Nr)、GO(Gene Ontology)数据库、COG(Clusters of Orthologous Groups of proteins)数据库、KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)数据库进行比较,对提交比对的序列进行功能注释。

1.5 差异基因分析

在序列比对完成后,参考基因组的注释文件,统计每个转录本在样本中的RPKM (Reads Per Kilobase of exon per Million fragments mapped)值,以该值作为该转录本的表达量。转录本丰度越高,则基因表达水平越高,通过对每个转录本的表达量进行样本间差异显著性分析,获得差异表达基因。以FDR≤0.05和Fold Change≥2为评判差异基因的显著性。所有的差异表达基因通过KEGG 数据库进行通路富集分析,并采用路径网络分析法,根据KEGG数据库路径间的关系,利用显著改变路径的代谢通路(P＜0.05)构建共表达网络[14]。

2 结果

2.1 转录组数据及组装

圆口铜鱼亲本和子代肝脏 cDNA样本经 Illumina HiseqTM2000平台测序后,每个样本获得了超过 6.00G的数据量,获得clean reads 共273204836条,占总reads的91.11%。去除接头序列、低质量序列后,碱基质量及组成分析显示,各样品Q30的碱基质量值比例均不小于94.55%,GC含量区间为45.83%—48.13% (表2)。序列经拼接和组装后,共获得80688个Unigene,长度主要分布在401—600 bp,占总Unigene的43.56%,Unigene 的 N50为683,表明组装完整性较高(表3)。

表 2 测序数据质量评估Tab.2 Quality evaluation of sequencing data

表 3 测序数据的统计汇总Tab.3 Summary statistic of the sequencing data

2.2 转录组功能注释

在拼接获得 genes 后,与公共数据库比对后进行功能注释,其中26494个unigene通过 Nr 数据库比对注释,比例最高为32.8%,9131个 unigene 通过 GO数据库进行功能注释,比例最低为11.3%(表4)。17175个unigene被注释到 25个 COG 功能家族,其中一般功能和一些未知功能数量较多,其次为翻译后修饰、蛋白质转化、蛋白伴侣、细胞内运输、分泌和水泡运输等功能基因(图1)。

2.3 亲本与子代差异表达基因聚类分析

分析结果显示,圆口铜鱼亲本与子代共获得2701个差异基因,其中子代显著上调基因有1240个,显著下调基因1461个。进一步对差异表达基因进行聚类热图分析(图2),结果显示,圆口铜鱼亲本和子代高低表达的基因分别聚在一起,同一样本不同重复基因表达相似。

表 4 基因注释结果统计Tab.4 Statistics results of the gene annotation

图1 Unigenes 的 COG 分类Fig.1 Clusters of orthologous groups classification of Unigenes

图2 亲本和子代差异基因表达模式聚类热图Fig.2 Cluster heatmap of differentially expressed genes of YQ and YZ

2.4 亲本与子代差异表达基因KEGG通路富集与路径网络分析

将差异基因所反映的代谢通路进行KEGG富集分析,结果显示,圆口铜鱼亲本与子代在代谢通路上最显著富集的有脂肪酸的代谢通路(Fatty acid metabolism)、脂肪酸生物合成通路(Fatty acid biosynthesis)、胰腺分泌通路(Pancreatic secretion)等(图3)。

对KEGG中37个显著富集的代谢通路(P＜0.05)构建其基因共表达网络,其中丙酸盐代谢(Propanoate metabolism)、丙酮酸代谢(Pyruvate metabolism)、原核生物固碳途径(Carbon fixation pathways in prokaryotes)、乙醛和二羧酸代谢(Glyoxylate and dicarboxylate metabolism)、脂肪酸代谢、萜类骨架生物合成(Terpenoid backbone biosynthesis)是KEGG差异表达基因的核心代谢途径,与其他途径具有较复杂的相关性,且这些基因在圆口铜鱼子代中表达量均显示上调(图4)。

图3 差异基因代谢通路KEGG显著富集结果Fig.3 The significantly enriched pathways and corresponding DEGs number of each pathway

3 讨论

转录组学是通过研究RNA 在组织或细胞内的生物过程和功能,从整体水平出发来表示特定生物学过程中的分子作用机理[15]。该技术可在不预先设计探针的情况下对不同物种进行转录组测序,相关数据在反映细胞内生物过程时,也比蛋白组的数据更全面[16]。截至目前,未看到有关圆口铜鱼转录组测序的报道,本研究在没有参照基因组对照的情况下,对所测得的序列从头拼接,获得了80688条Unigene,平均长度分别达到694.7 bp,通过抽样与GenBank中的序列比对,发现拼接质量较好,表明针对圆口铜鱼的转录组测序数据可靠、有效。

与 NCBI Nr数据库比对结果显示,圆口铜鱼转录组数据与已知基因可以比对到26494条,占总数的 32.8%,说明仍有约70% 的基因未能比对到NR数据库中。另外,通过在公共数据库GO、COG和 KEGG 中功能注释显示,本试验中只有15%左右的Unigene序列被注释到,说明铜鱼属鱼类的基因序列在国际公共数据库中收录的较少。尽管这样,本研究获得的Unigene可大大丰富现有数据库中铜鱼属基因资源。另外可通过功能注释,了解一些特定基因的功能、参与的生物过程以及相关代谢通路等,为进一步圆口铜鱼的功能基因挖掘等提供数据支撑。

图4 KEGG显著富集通路相互作用网络Fig.4 Network of significantly enriched pathways in KEGG

本研究对圆口铜鱼亲本和子代肝脏转录组进行比较分析,获得了亲本和子代间差异表达的基因2701个,通过KEGG pathway富集分析,发现差异性的代谢通路集中在脂肪酸的代谢、吸收和合成、胰腺分泌等。进一步构建了KEGG中显著富集的代谢通路(P＜0.05)中基因共表达网络,其中核心代谢途径主要包括丙酸盐、丙酮酸、脂肪酸、原核生物固碳途径、萜类骨架生物合成等,且与这些通路相关的基因在子代圆口铜鱼中显著上调。一方面可能由于子代处于快速生长阶段,其生长速率和代谢水平与性成熟的亲本圆口铜鱼不同而至。已有研究指出,鱼类生长的一般规律为幼鱼时期生长速率较快,随年龄的增加逐渐趋平缓甚至下降[17]。另一方面可能与子代免疫反应活性相关。应正宙和王志伟[10]指出鱼类免疫反应活性与肝脏代谢水平直接相关。丙酸盐代谢产物和丙酮酸的代谢产物是典型的短链脂肪酸,对机体具有重要的生理功能如能量代谢、体液平衡等[18]。肝脏是丙酸盐代谢的主要器官,在反刍动物中能够调节其血糖平衡、缓解炎症、增强免疫力,维持机体健康[19]。有研究指出,丙酸能降低奶牛血液中β-羟丁酸(β-hydroxybutyrate,BHBA) 浓度,减少尿酮的产生,升高血糖浓度,调节胰岛素分泌,维持血糖平衡,同时也可以控制甘油三酯,若甘油三酯的合成量,预防脂肪肝形成[20]。另外,丙酸盐也被指出能够改善里海白鱼Rutilus frisii kutum[21]、斑马鱼Danio rerio[22]等鱼类的黏膜和非特异性免疫反应,提高鱼类的免疫力和生长性能。因此,根据本研究中丙酸盐、丙酮酸等核心代谢途径在子代肝脏中显著上升的结果,推测圆口铜鱼子代免疫反应活性要高于亲本,从分子水平上解释了在同一循环水系统中圆口铜鱼亲本易患小瓜虫病,而子代确未发现患病的现象。相关实验室的验证实验将在下一步开展。

近年来,针对圆口铜鱼开展的研究主要集中在生殖与发育[23]、生理生化[24]、遗传多样性[25]、驯养[26]、应激缓解[27]等方向,但在鱼类应激反应的分子机制方面,由于基础数据的缺乏,尚未开展更深入的研究。本试验通过转录组测序获得的圆口铜鱼转录组序列和基因注释结果,将有助于圆口铜鱼应激反应的分子机制研究,加快圆口铜鱼功能基因挖掘和利用。