人参抗CINV的药效物质基础研究＊

刘成琳，孟 莉，王 静，朱春璐，张会宗，袁子民

（1. 辽宁中医药大学药学院 大连 116600；2. 辽宁中医药大学 沈阳 110847）

化疗是通过使用化学治疗药物杀灭癌细胞达到治疗目的的方法，是目前治疗癌症最有效手段之一。化疗药物会损害体内正常细胞，副作用明显。例如，在服用化疗药物后不同时间内可出现急性呕吐、延迟性呕吐和预期性呕吐，严重影响患者的身体健康[1]。目前，临床治疗CINV 的药物以西药居多，多需联合用药，价格昂贵，副作用显著，且不宜长久及大量使用。相比而言，中药与化疗药物合用，通过整体调控和多因素调节，发挥协同抗癌作用，具有副作用小、价格低廉等优点，引起世界范围内的广泛关注。例如，Aung等[2]研究发现，西洋参中人参皂苷可增强顺铂的活性，人参皂苷除减弱化疗引起的恶心呕吐外，还可能与化学治疗剂在治疗癌症中发挥潜在的补充作用。

人参味甘、微苦、微温，具有“大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津养血，安神益智”的功效[3]。《名医别录》中最早记录了人参具有降逆止呕的作用，人参抗CINV 的研究属于中药新功能挖掘的范畴。Mehendale等[4]研究表明，西洋参浆果提取物和人参皂苷Re 能够有效抑制由顺铂引起的大鼠异嗜癖，并改善了正常食物的摄入。另外，Kim等[5]发现韩国红参提取物能够显著减弱顺铂引起雪貂的恶心呕吐；Sathyanath 等[6]用低剂量的韩国红参皂苷部分和高剂量的非皂苷部分预处理大鼠，发现皂苷部分和非皂苷部分均可抑制由顺铂导致的大鼠异嗜癖。上述西洋参、韩国红参与人参同属五加科植物，对人参抗CINV 研究具有一定的启示作用。实验前期，通过人参止呕文献考证[7]及大鼠异嗜高岭土模型实验，初步证实人参原粉具有抗CINV 的作用[8]。现代研究表明，人参皂苷Rg3可通过上调LOVO 细胞E－cadherin 蛋白表达，抑制肠癌细胞LOVO 增殖[9]；人参皂苷Rg3可刺激Th1细胞表达，调节Th1/Th2比例，提高患者免疫力，达到抗肿瘤[10]作用；人参皂苷Rh2具有诱导子宫内膜癌凋亡的能力[11]；小剂量人参多糖可抑制人肝癌BEL-7402 细胞生长[12]。佟彤等[13]发现，人参多糖能够有效逆转环磷酰胺造成的T淋巴细胞亚群中CD4+/CD8+比例减小，CD69+细胞CD3+T细胞比例升高，提高人体免疫力，抑制肿瘤。上述研究表明，人参与化疗药物合用，抗CINV 同时，其化学成分人参皂苷和多糖可通过抑制肿瘤，提高人体免疫力，同化疗药物发挥着协同抗癌作用，达到攻补兼施、标本兼治的目的。

为进一步明确人参抗CINV 作用的活性组分，本实验采用顺铂致大鼠异嗜高岭土模型，对人参不同极性溶媒提取物进行抗CINV 作用研究。同时，绘制不同极性提取组分的HPLC 指纹谱，通过谱-效相关分析，初步确定人参抗CINV 的活性成分，为人参抗CINV的物质基础与作用机制分析提供研究基础。

1 材料

1.1 仪器与试药

本实验采用岛津LC-2010HT高效液相色谱仪，包含LCsolution 化学工作站、VWD 检测器、自动进样器（日本岛津有限公司）。

人参购于亳州千草药业有限公司，经辽宁省中医药研究院张会宗研究员鉴定为五加科植物人参PanaxginsingC. A. Meyer.干燥的根及根茎；人参皂苷Rg1、Rb1、Re（中国食品药品生物制品检定研究院，批号分 别 为110703-201832、110704-201827、110754-201827，供含量测定用。）；盐酸昂丹司琼注射液（齐鲁制药有限公司，批号：7K04141016）；注射用顺铂（江苏豪森药业集团有限公司，批号：180201）；高岭土（上海源叶生物科技有限公司，批号：20181017）；D101 型大孔吸附树脂（国药集团化学试剂有限公司，批号：20170622）；水为纯净水，甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.2 动物

SPF 级昆明种大鼠，雄性，体重180～220 g，购自辽宁长生生物技术有限公司，合格证号：SCXK（辽）2015-0001。

2 方法

2.1 人参水提液及不同极性提取物的制备

精密称取人参粗粉200 g，置圆底烧瓶中，加10 倍量水，加热回流2 h，得到水煎液，药渣继续同上操作，加8 倍量水，加热回流2 h，药渣继续同上操作，加6 倍量水，加热回流2 h，合并滤液，浓缩至1000 mL，得人参水提液。取人参水提液加入乙醇使其水提液的乙醇浓度达到80%，在4 ℃下放置过夜，抽滤得沉淀物，烘干，即得醇沉组分；将滤液回收乙醇至无醇味，通过D101型大孔吸附树脂，依次用水、60%乙醇、90%乙醇洗脱，分别收集相应洗脱液，减压回收溶剂，得不同极性提取物，分别加水适量使各不同极性提取的浓度相当于生药量1 g/mL。

2.2 人参水提液及不同极性提取物抗CINV 的活性研究

2.2.1 大鼠适应性实验

高岭土饲料是由高岭土加10%阿拉伯胶溶液制备而成，其形状与大鼠正常饲料相似。实验前对大鼠进行适应性饲养，将正常饲料与高岭土饲料等量后，同时给予大鼠，并每天定时将饲料取出称重，至大鼠不在啃食高岭土为止，进入正式实验。

2.2.2 顺铂剂量对大鼠异嗜高岭土模型的影响

将大鼠随机分为4 组，每组6 只，第1 组灌胃生理盐水10 mg/kg作为空白对照，第2～4组腹腔注射顺铂，顺铂剂量分别为3 mg/kg、5 mg/kg 和7 mg/kg。观察各自在给予顺铂后96 h 内大鼠异嗜高岭土行为，并计算每只大鼠每天内高岭土和正常饲料摄入量，结果见图1。

2.2.3 人参水提液及不同极性提取物的止呕作用研究

将大鼠称重，随机分为8 组，每组8 只，分为空白对照组、模型对照组、水提液组、醇沉组、水冲洗组、60%乙醇洗脱组、90%乙醇洗脱组、盐酸昂丹司琼组。人参不同极性提取物按5 g/kg 给药，盐酸昂丹司琼组按2 mg/kg 给药。每天给药一次，连续六天，空白对照组和模型对照组按体重给予等容积的蒸馏水。于第三天给药后30 min，除空白对照组外，其余各组腹腔注射顺铂5 mg/kg，记录各组给药后96 h内高岭土和正常饲料摄入量以及体重的变化，并计算每只大鼠每天高岭土和正常饲料摄入量以及体重的变化，结果见图2和图3。

2.3 人参不同极性提取物指纹图谱建立及谱效相关研究

2.3.1 色谱条件

谱柱：Diamondil TM（钻石）C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速；1.0 mL/min；检测波长203 nm；柱温：30 ℃；流动相A 为乙腈，流动相B为0.1%磷酸溶液，二元线性梯度洗脱0～30 min：81% B (19%A)；30～35 min 81→76% B (19→24%A)；35～60 min 76→60% B (24→40%A)。

2.3.2 人参不同极性提取物供试品溶液的制备

精密量取人参不同极性提取物的水溶液适量（相当于人参药材1 g），置于10 mL 量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，得滤液。

2.3.3 对照品溶液制备

取对照品人参皂苷Rg1、Re、Rb1适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 含人参皂苷Rg10.2172 mg、人参皂苷Re 0.1990 mg、人参皂苷Rb10.2002 mg 的混合对照品溶液。

2.3.4 人参不同极性提取物指纹图谱测定

分别精密量取“2.3”项下的各供试品20 μL，用高效液相色谱分析，获得人参不同极性提取物的指纹图谱，结果见图4。

2.3.5 谱效相关研究

利用SPSS19.0 软件对指纹图谱不同色谱峰面积和药效学指标分别进行相关分析与回归分析，确定人参抗CINV的药效物质基础。

3 结果

3.1 顺铂剂量的选择

各剂量顺铂均能引起大鼠明显异嗜高岭土行为，并抑制大鼠饲料摄入量，与空白对照组比有显著性差异，但实验结束后发现顺铂7 mg/kg 剂量组，大鼠有死亡现象，且死亡率达到了50%，因此选择顺铂5 mg/kg为造模剂量，如图1。

图1 顺铂剂量的选择（±s，n=8）

3.2 人参水提液及不同极性提取物的止呕作用结果

人参水提液组、60%乙醇洗脱组可均抑制顺铂所致的呕吐，与模型对照组对比具有显著性差异（P≤0.05），主要表现为大鼠异嗜高岭土饲料减少，醇沉组分、水洗脱组分、90%乙醇洗脱组分无显著性差异（P＞0.05）。如图2。

图2 人参不同极性提取物对大鼠异嗜高岭土情况（±s，n=8）

3.3 人参不同极性提取物指纹图谱与药效学研究

3.3.1 人参不同极性提取物指纹图谱制定

人参不同极性提取物的指纹图谱中如图4，共指认出11个色谱峰，分别标记为X1～X11。

图3 96 h内大鼠体重变化（±s，n=8）

3.3.2 相关分析

本实验采用SPSS19.0 版统计软件对药理结果和11个色谱峰面积进行双变量相关分析，得到二者的皮尔逊相关系数，结果见表1。由表1 可知，与高岭土摄入量相关的色谱峰有X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11。

3.3.3 回归分析

采用SPSS19.0版统计软件，对11个色谱峰面积和药理结果进行逐步回归分析，得到回归方程，其中X1、X8、X10被引入回归方程，标准化回归方程为：Y=-1.367×10-6X8-3.059×10-8X1-5.499×10-7X10+5.301。

图4 人参不同极性提取物的HPLC指纹图谱

表1 11个色谱峰面积与高岭土摄入量皮尔逊相关系数

综合相关分析和回归分析可得，色谱峰X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11与大鼠异嗜高岭土显著负相关，与药效预期结果一致。在回归分析中X1、X8、X10被引入回归方程，提示X1、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11可能是人参抗CINV 的物质基础，其中X3、X4、X8分别为人参皂苷Rg1、Re、Rb1。

4 讨论

化疗药物引起食欲减退、恶心纳差、脘腹胀痛，重者剧烈呕吐、难以进食、腹痛腹泻，甚至出现血性腹泻等消化道反应，是最常见的毒副作用[14-15]。中医学认为，脾胃主受纳运化，乃人体后天之本，气血生化之源，如能完成水谷的运化，患者机体就能得到充足养分抵抗化疗药物对机体正常细胞的损害，完成化疗[16-17]。为此，化疗的同时，注意保护胃气、调理中焦，使胃气盛、气血旺，显得尤为重要，故临床常用人参健脾汤、六君子汤等进行调理。另外，参麦注射液能提高肿瘤病人的免疫功能，与化疗药物同用，具有增效作用，能改善患者健康状况，保护和提高骨髓造血功能，增强肿瘤患者的细胞免疫功能，提高肿瘤缩小率，达到解毒增效的目的[18]。据文献报道[19]，用人参注射液治疗32例癌症患者化疗所致白细胞下降，总有效率达到87.5%。这表明人参能防止多种原因引起的白细胞下降，增强机体免疫力，降低药物化疗的不良反应。

在研究呕吐实验时，常采用动物模型，包括雪貂、狗和大鼠，每种模型都与一些限制因素相关，例如成本、处理动物的容易程度、没有呕吐中心以及无法呕吐[20-21]。本实验采用大鼠异嗜高岭土模型观测人参不同极性提取物治疗CINV 的效果。实验大鼠虽缺乏催吐反射弧的运动成分，不能产生呕吐，但大鼠对顺铂、吗啡、放射线和模拟晕动病引起的恶心呕吐，可通过增加非营养物质如高岭土的摄入（异食癖）来响应恶心呕吐刺激[4,21]。本实验给药后30 min 注射顺铂，发现大鼠精神状态较空白对照组差，推测可能为中药起效慢的结果，后调整为连续三天给药后再注射顺铂；顺铂剂量筛选过程发现，高剂量组有一定的致死率且高岭土和饲料摄入量与低、中剂量组比无显著性差异（P＞0.05），其中低、中剂量组无死亡且与空白对照组比较，高岭土摄入量显著增多。综合分析选择中剂量5 mg/kg为顺铂造模剂量。大鼠异嗜高岭土实验显示，人参水提液和60%乙醇洗脱组分均具有抗CINV 作用（P≤0.01）；醇沉组分、水洗脱组分、90%乙醇洗脱组分抗CINV 作用不显著（P＞0.05）。其中60%乙醇洗脱部分主要为人参皂苷，醇沉组分为多糖，表明人参抗CINV 作用的主要成分为皂苷类。同时人参水提液组、醇沉组、60%乙醇洗脱组、90%乙醇洗脱组可显著降低由顺铂引起的体重减轻，推测可能与人参皂苷和多糖增强机体免疫力和适应原作用相关。实验中每组大鼠的饲料摄入量均无显著性差异（P＞0.05），推测可能与顺铂抑制胃排空有关[2]。

预实验对HPLC 指纹谱的检测波长、流动相进行了筛选，发现在203 nm 处检测，色谱峰较多，乙腈-0.1%磷酸缓冲液梯度洗脱系统较甲醇-水梯度洗脱系统的基线漂移小，在该梯度洗脱条件下更利于色谱峰的分离，并结合《中华人民共和国药典》一部“人参”项下人参总皂苷特征图谱的测定方法，确定了实验HPLC指纹谱的色谱条件[3]。

本实验采用双变量相关分析和逐步回归分析，初步推测10个色谱峰与人参抗CINV的相关性。通过与对照品比对，确定了X3、X4、X8色谱峰分别为人参皂苷Rg1、Re、Rb1。上述三个化学成分与有关文献报道的抗肿瘤、增强免疫功能相协同；其他7个化学成分有待进一步鉴别，10个化学成分之间是否存在协同作用也有待进一步确证。