纳洛酮对蛛网膜下腔出血大鼠海马区神经细胞自噬的影响

2020-08-07李小亮李君李林孙林林陈扬付爱军

安徽医药 2020年8期

李小亮，李君，李林，孙林林，陈扬，付爱军

作者单位：1华北理工大学附属医院神经外科，河北唐山063000；2开滦总医院林西医院神经外科，河北唐山063000；3郑州市第七人民医院神经外科，河南郑州450000

自发性蛛网膜下腔出血（SAH）是严重威胁人类健康的一种疾病，由于其发病突然、变化迅猛，给救治带来很大的挑战，绝大多数SAH为动脉瘤破裂所致［1］，据不完全统计SAH发病率约为每年10.5∕10万人口［2］，并且呈逐年上升趋势。随着显微脑血管外科、高分辨率影像后处理技术、麻醉理论及血管内介入水平的不断发展及提高，其病死率较前有所下降，但致残率一直处于较高水平［3］，治疗后大概33%的SAH病人遗留严重的神经功能缺失并需长期护理［4］，给病人和家庭带来沉重的经济负担以及身心上的双重创伤［5］。既往的学者认为，导致SAH病人神经功能缺失的主要因素为脑血管痉挛（CVS）［6］，但是应用药物拮抗CVS的发生后，并未显著改善SAH病人的神经功能缺失。近年来文献报道，应用药物或其它措施对SAH早期脑损伤的尽早干预，可以减轻神经功能缺失［7］。目前对SAH早期脑损伤的机制研究中，自噬被广泛关注，适当活化的自噬可以减轻大鼠SAH模型早期脑损伤的损害性发展，从而保护神经功能［8］。纳洛酮注射液是阿片类受体阻滞剂，在临床上普遍使用，并取得了不错的疗效。有研究报道纳洛酮注射液在治疗SAH所致的脑损伤方面具有积极的意义［9］，但相关机制尚不明确。

本研究于2016年10月至2018年10月采取刺破颈内动脉的方法制作SAH大鼠模型，观察纳洛酮注射液对大鼠行为学功能及自噬相关蛋白Beclin-1及微管相关蛋白1轻链3（LC3-Ⅱ）的影响，探讨纳洛酮注射液对SAH的可能作用机制，为临床治疗提供丰富的基础医学支持。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 实验动物 108只健康雄性清洁级SD大鼠，周龄范围为9～12周，体质量（350±30）g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证号SCXK（京）2014-0004。饲养于华北理工大学动物实验中心动物饲养室，正常通风光照，维持室温于（23±2）℃，湿度控制于（50±15）%，自由活动并正常饮水进食，避免不良刺激。在实验开始前1周进行环境适应。采用随机数字表法将108只大鼠分为三组，依次为假手术组、SAH组、纳洛酮组，每组36只，并相应做好标记，每组再依次分为6 h、24 h、72 h三个亚组，每个亚组12只。本研究符合一般动物实验伦理学原则。

1.1.2 药物和试剂纳洛酮注射液（1 mL∶0.4 mg）；Beclin-1（ABclonal生物技术有限公司）和LC3-Ⅱ抗体（GeneTex生物技术有限公司）；内参微管蛋白（tubulin）（美国Abcam公司）；二抗及显色用品（美国KPL公司）。

1.1.3 主要仪器 820-Ⅱ型切片机（德国Leica公司）；OLYMPUS摄像显微镜（日本奥林巴斯公司）；凝胶成像分析系统；图像采集及分析系统。

1.2方法

1.2.1 模型建立根据文献采用颈动脉刺破法制作SAH大鼠模型［10］：腹腔内注射10%水合氯醛（300 mg∕kg）麻醉大鼠，刺激无反应后将其仰卧并固定，颈部术前无菌处理，纵行剪开，沿组织间隙进行分离，暴露并解剖颈总动脉及颈内外动脉，远心端扎闭并剪断颈外动脉，牵拉使其与颈内动脉进入颅内的方向一致，将锐化并标记好的纤芯自远心端穿入颈外动脉并沿颈内动脉直至颅内，刺破血管，造成SAH模型。然后将伤口消毒后缝合，正常饲养。以取脑时环池、基底池有血凝块为模型制备成功的标准。假手术组只将纤芯沿血管穿入颅内，避免刺穿血管，其它操作步骤与SAH组相同。

1.2.2 给药方法纳洛酮组刺破颅内血管后立即给予腹腔内注射纳洛酮注射液（1 mg∕kg），每12小时1次，用药至处死的各时相点。假手术组和SAH组采用同样方法给予同等体积的0.9%氯化钠溶液。

1.2.3 穿梭箱实验各组实验大鼠于造模前2 d开始进行训练，每天练习2次，以培养条件反射。术后于预设时间，首先在穿梭箱内让实验大鼠进行环境适应5 min，达到去除条件反射的目的，然后给予5 s声光刺激，再给予20 s电刺激（电击强度30 V，50 Hz）。观察大鼠的逃避情况，每间隔20 s训练1次，共计30次。视频分析实验大鼠的逃避情况。统计逃避次数及逃避反应时间（大鼠受到刺激至逃到安全区的平均次数与时间）。

1.2.4 苏木精-伊红（HE）染色于造模成功后的各个时间点，采取腹腔内注射10%水合氯醛（300 mg∕kg）将大鼠深度麻醉，待其无反应后进行左心室穿刺灌注，先灌注0.9%氯化钠溶液500 mL、再灌注4%多聚甲醛250 mL，在冰上解剖取出脑组织，并置于4%多聚甲醛中固定3 d。对固定好的脑组织进行常规石蜡包埋，层厚5μm做连续冠状位切片（包含海马组织），每只大鼠脑标本蜡块取3张进行HE染色。光学显微镜（×400）观察海马CA1区神经细胞形态及结构，按随机数字表法保存6个不同视野的照片，并用Motic-6.0分析系统统计结构无异常的神经细胞数量。

1.2.5 免疫组织化学染色每只大鼠脑标本蜡块取6张切片，进行常规脱蜡、水化、高压修复、室温孵育。按随机数字表法等分成2组，一组滴加Beclin-1抗体（1∶100），另一组滴加LC3-Ⅱ抗体（1∶100），将滴加抗体的切片放入4℃冰箱过夜（超过12 h），滴加组化二抗，孵育、脱水、透明、显色、封固。光学显微镜（×400）观察海马CA1区神经细胞，按随机数字表法保存6个不同视野的照片，并用Motic-6.0分析系统统计阳性细胞数量。

1.3统计学方法使用Excel 2007收集计量资料，所得数据以xˉ±s表示，使用SPSS17.0软件进行单因素方差分析，采用LSD-t检验进行多组间的两两比较。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1穿梭箱实验与假手术组对比，SAH组6 h、24 h、72 h大鼠躲到安全区的次数均减少，躲到安全区的时间均延长（P＜0.05）；与SAH组对比，纳洛酮组6 h、24 h、72 h躲到安全区的次数均增多，躲到安全区的时间均缩短（P＜0.05）。见表1，2。

表1各组大鼠各时间点逃避反应次数比较∕（次±s）