IL-19/IL-20基因多态性与中国汉族人群结直肠癌易感性的研究*

杨 康，王田甜，孙毅松，冉璐瑶，施松廷，蒋佩文,李 华，杨 平△，李敏惠

1.成都医学院 基础医学院(成都610500)；2.成都医学院 生物科学与技术学院(成都610500)；3.成都医学院 检验医学院(成都610500)；4.西部战区总医院 肿瘤科(成都610083)；5.成都医学院 科研实验中心(成都610500)

近年来，随着人们生活方式和饮食习惯的改变，结直肠癌(colorectal cancer，CRC)在我国的发病率和死亡率呈逐年递增趋势[1]，预计2020年CRC发病率将达到20.7/10万[2]。炎症与CRC发生发展间的密切关系已得到广泛认可。慢性炎症被普遍认为是CRC发展中的重要病理成分，炎症引起的细胞因子和趋化因子的释放在肿瘤微环境中可调节肿瘤细胞的生长、分化和存活，有助于肿瘤的进展[3]。因此，炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)被认为是诱发CRC的三大高风险诱因之一[4]，且IBD患者发展成为CRC的风险较正常人显著升高[5]。

遗传变异如单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)，在CRC易感性中发挥着重要的作用[6]，基于炎症与CRC的关联性，炎症因子基因多态性与CRC易感性研究已成为研究热点之一。Al Obeed等[7]研究就发现，IL-17基因多态性与中东人群CRC易感性显著相关，提示炎症因子的基因多态性可能与CRC易感性密切相关。IL-19/IL-20位于1号染色体q32位置，基于其在基因结构、蛋白质结构和受体方面的相似性，将其划分为IL-10基因家族，其在炎性疾病中发挥着重要作用[8-9]。在研究IL-20亚家族(IL-19、IL-20、IL-22、IL-24和IL-26)与肠道疾病的关系时，研究[10]结果显示IL-19和IL-20细胞因子在IBD的发生发展中扮演着重要角色，在溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn's disease,CD)患者中，其表达量显著升高。同时，研究[11]发现IL-19基因多态性与墨西哥人群UC易感性密切相关，其SNP位点rs2243188和rs2243193可能是墨西哥人患UC的保护因素。该研究团队还探讨了IL-20基因多态性与墨西哥人群UC易感性的关系，结果显示IL-20基因的2个SNP位点(rs2981573和rs2232360)的GG基因型为UC易感基因型。由于炎症与许多恶性肿瘤的发生发展有着密切的联系，因此，探究炎症相关基因与肿瘤的关系显得尤为重要。目前关于IL-19/IL-20基因多态性与CRC是否相关联尚未见报道。因此，本研究选取IL-19/IL-20基因的5个SNP位点进行基因型测定及关联性分析，探讨IL-19/IL-20基因多态性与CRC的关联性，以明确2个基因遗传变异在我国汉族人群CRC发生发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集2018年2月至2019年2月西部战区总医院收治的94例原发性CRC患者的外周血样本。通过筛选，所有样本均来自无血缘关系的汉族人群，94例CRC病例组的筛选标准参照中国医学会肿瘤学分会制定的《中国结直肠癌诊疗规范(2017版)》[12]。病例组男52例，女42例，年龄23.0～88.0(55.0±12.8)岁；将同一时期在该医院体检中心接受常规检查且无CRC病史或相关症状的94例健康体检者作为对照组，其中男52例，女42，年龄23.0～88.0(55.0±12.7)岁。本研究经西部战区总医院伦理委员会同意，患者签署知情同意书。在收集样本的同时对样本的性别、年龄、病情等临床资料进行信息编号，并建立相应的数据库。两组人群在年龄、性别比例等一般资料方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性(表1)。

表1 两组一般资料比较

1.2 SNP的选择

从HapMap数据库中下载中国汉族人群CHB 1号染色体IL-19和IL-20基因区域的数据，利用Haploview软件进行标签位点(Tag SNP)的选择。本研究对这2个基因的SNP位点进行了标签位点分析，通过设定MAF=0.1，r2阈值为0.8，LOD阈值为3.0来筛选Tag SNP。最后确定了IL-19基因的4个待测位点(rs1028182、rs2243158、rs2243191、rs1798)和IL-20的1个待测位点(rs1400986)。

1.3 研究方法

本研究采用病例-对照一一匹配的实验方案，即每个病例样本均有1个性别、年龄、民族和居住地完全相同的健康对照样本。用标准方法从血液单核细胞中提取基因组DNA，基于SNP stream检测系统遵循多重PCR引物设计原则设计相应引物，采用SNP stream超高通量基因分型系统针对这5个待测位点对CRC患者(n=94)和匹配的健康对照(n=94)的血液样本进行基因分型。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0统计软件进行数据处理。采用Pearson2goodness-of-fit test检验考察试验所收集的样本是否符合Hardy-Weinberg平衡。两组间各SNP位点等位基因型频率和基因型频率的分布差异采用Pearson Chi-Square test和逻辑回归进行检验。并通过SNP stats在线平台确定其单倍型。采用条件逻辑回归分析方法评价各位点基因型与CRC及CRC临床资料的关联性。利用Haploview软件对IL-19的2个位点进行连锁不平衡分析，并在软件中生成LD图，连锁不平衡的程度由标准化的D′值来衡量。所选位点的单倍型分析在SNP stats在线平台上(http://bioinfo.iconcologia.net/snpstats/start.htm)进行。每次分析均计算相应的P值、比值比(OR)及95%可信区间(95%CI)。检验水准α除特别说明外均设定为0.05。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡检验结果

表2 两组受检者IL-19/IL-20基因5个多态性位点Hardy-Weinberg平衡分析结果

2.2 IL-19/IL-20基因5个SNP位点多态性分布

表3 两组IL-19/IL-20基因5个多态性位点等位基因型及基因型分析结果[n(%)]

2.3 IL-19基因4个SNP位点组成的单倍型频率分布

采用Haploview4.2软件对IL-19基因4个多态性位点(rs1028182、rs2243158、rs2243191、rs1798)进行连锁不平衡分析，并用SNP stats在线分析软件对这4个多态性位点进行单倍型分析，结果显示：4个位点均呈现不同程度的连锁不平衡关系，应用SNP stats在线分析软件共构建5种单倍型。以TGTG单倍型为参考，结果显示：其余4种单倍型在两组间分布比较，差异无统计学意义(P>0.05)(表4、图1)。

表4 两组IL-19基因4个多态性位点单倍型分析结果

3 讨论

IL-19/IL-20作为IL-10家族的成员，其不仅在机体炎症反应中发挥重要作用；同时在肿瘤的发生发展中扮演着重要角色。Chen等[13]在IL-19与乳腺癌的关联性研究中发现，IL-19能直接促进肿瘤的增殖和迁移，为肿瘤细胞生长提供微环境。与之相比，IL-20参与了多种肿瘤的发生发展，如肝癌[14]、前列腺癌[15]和口腔癌[16]等；上述研究结果均显示，抗IL-20单克隆抗体能有效抑制肿瘤生长，IL-20有望成为治疗多种癌症的新靶点。以上研究提示IL-19/IL-20基因不仅与炎症疾病密切相关，并且极有可能在CRC及其他类型的恶性肿瘤疾病中也发挥着重要作用。

目前，不少研究揭示炎症相关基因多态性与CRC易感性存在密切的联系。Shamoun等[17]发现IL-32基因多态性与CRC易感性有关，其多态性位点rs28372698与IL-32蛋白在CRC组织中的表达上调相关联。有研究[18]通过遗传变异阐述了IL-17A基因多态性与CRC的关系，该研究发现IL-17A基因SNP位点rs10484879及该基因的单倍型AGGTG和GAGTG是CRC易感因素。目前，还没有IL-19/IL-20基因多态性与CRC易感的相关研究，本研究选取IL-19/IL-20作为目的基因，筛选出IL-19基因的4个标签SNP位点(rs1028182、rs2243158、rs2243191、rs1798)和IL-20基因的1个标签SNP位点(rs1400986)，但测定结果未发现这5个标签SNP位点与中国汉族人群CRC易感性相关。本研究同时对IL-19基因的4个多态性位点进行了连锁不平衡分析，用以探讨IL-19基因4个多态性位点所构成的单倍型与CRC易感性的关联，结果显示供试基因4个SNP位点所构成的单倍型与CRC易感性无相关性。

值得注意的是，IL-19基因SNP位点rs2243158的相关基因型被发现是儿童患膀胱输尿管反流的危险因素[19]，但该位点的次等位基因在斑块型银屑病的易感性研究中却提示有显著的保护作用[20]；同样的情况也出现在IL-20基因多态性位点rs1400986上，在研究银屑病易感性基因多态性时，结果显示，该位点T等位基因的携带者是患银屑病的保护因素，但在幼年特发性关节炎(juvenile idiopathic arthritis，JIA)疾病的研究结果中却显示出该位点多态性是患JIA的危险因素[21]。该类研究表明，IL-19/IL-20基因多态性与疾病的相关性在不同研究中存在差异，可能是由于疾病类型、遗传差异性、样本人群的不同及研究方法的差异导致；其次，也可能是本研究所选的TagSNP位点未能很好的反映其所在区域的整体情况；亦或者是因为CRC的发病是由多个基因共同调控的，IL-19/IL-20基因作为炎症相关基因，在调控CRC发病的机制中不占据主要地位。

综上所述，为深入探究IL-19/IL-20基因多态性位点与CRC的相关性，下一步研究将扩大样本量和样本收集范围，并且收集多种族人群，纳入更多IL-19/IL-20基因的功能性SNP位点及相关通路其他基因(STAT、JAK等)的SNP位点，进一步完善CRC发病机制的研究，为临床预防、诊断、治疗CRC提供理论依据。