一株降解苯酚芦苇内生菌的分离与鉴定

王清东 李玉玺 王乙羽 刘慧敏 刘俊华 张孝霖

摘 要：为得到高效苯酚降解菌，以黄河三角洲盐碱地生芦苇（Phragmites australis）为材料，分离出1株能降解苯酚的芦苇内生菌L12，該菌能在以苯酚为唯一碳源的培养基上生长。采用4-氨基安替比林分光光度法测苯酚降解率，对该菌株的形态特征、理化性质、16S rDNA基因序列进行研究。结果表明：该菌株呈杆状，革兰氏染色呈阴性，初步鉴定为假单胞菌（Pseudmonas sp），能有效降解苯酚。

关键词：苯酚降解菌;芦苇;假单孢杆菌;理化性质

中图分类号 Q93-331文献标识码 A文章编号 1007-7731（2020）14-0040-03

Abstract：In order to obtain a hyper efficient phenol-degrading bacterium strain， Phragmites australis in saline-alkali soil of the Yellow River Delta was used as the material to isolate a Phragmites australis endophytic bacteria L12， which was able to degrade phenol. The bacteria can survive on the medium with phenol as the sole carbon source. Phenol degradation rate was measured by 4-aminoantipyrine spectrophotometry. Further studies involving morphological characteristics， physicochemical properties and 16S rDNA gene sequence showed that the strain was rod-shaped and Gram-negative. Its then identified as Pseudmonas sp. The results showed that a Pseudomonas endophyte was obtained from reed， which can degrade phenol effectively.

Key words：Phenol degrading bacteria; Phragmites australis; Pseudmonas sp; Physicochemical properties

近年来，苯酚等酚类化合物在农药、造纸和医药等众多行业中得到广泛应用[1，2]，但苯酚对许多生物体具有较强的毒害作用，已被许多国家列入重点污染物名单[3-5]。含有大量苯酚类污染物的污水被排入河流和土壤中，严重污染环境，危害人类健康，因此，消除苯酚类污染物的毒害作用对有效保护环境和人体健康具有重要意义。目前，清除工业废水中苯酚的方法主要有物理法、化学法及生物法。生物法主要是利用微生物的新陈代谢将苯酚类污染物转化为无毒物质，与物理和化学法相比，具有经济高效的特点，尤其是可以实现无害化处理，并且处理量较大，没有二次污染，而微生物自身种类繁多、适应强、潜能大，因此生物法是国内含酚废水无害化处理的首选方法[6，7]。虽然国内外对含酚废水的生物处理已有广泛研究，但仍不能满足工业应用和环境保护中的各种需求。笔者以黄河三角洲盐碱地生芦苇为研究对象，从中筛选出具有较强降解苯酚类污染物能力的菌株L12，为以后生物降解苯酚、降低环境中的苯酚类污染物提供参考，并对扩充苯酚降解菌的菌种资源库有实际应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品及试剂 试验样品为黄河三角洲盐碱地生芦苇，所用试剂与富集培养基、初筛培养基、发酵培养基等均参考姜立春[8]、刘桂萍等[9]的实验。

1.1.2 主要仪器设备 高压蒸汽灭菌锅、恒温摇床培养箱、超净工作台、紫外分光光度计、磁力搅拌器、恒温水浴锅、离心机、显微镜等。

1.2 方法

1.2.1 样品采集 用取样铲挖取黄河三角洲（38°14′5.8″N，117°49′2.22″E）盐碱地生芦苇放入冷藏式采样样品保存箱，带回实验室立即进行菌株的分离筛选。

1.2.2 菌种分离 （1）取芦苇的茎段用自来水冲洗，晾干后蒸馏水冲洗3次，将其浸泡在75%乙醇中1min，后用无菌水漂洗3次，再用0.1%次氯酸进行消毒后，用无菌水漂洗3次，取最后1次冲洗的无菌水100μL，涂布于PDA培养基培养24h，检验植株表面消毒是否完全。将表面消毒的植株切掉两端露出新组织，再接种于PDA平板28℃恒温静置培养5h。待培养基上有可见菌落时，挑取菌落分离纯化，保存单菌落备用。

（2）菌悬液的制备（湿重法）：用接种环分别挑取初筛平板上的单菌落，接种到装有100mL种子培养基的250mL锥形瓶中，30℃、160r/min摇床培养48h。8500r/min离心10min，弃上清液，重复3次，称湿重，用发酵培养基配制成质量分数为10%的菌悬液。

（3）发酵培养：按照1%的接种量，将各菌株菌悬液接种到装有50mL发酵培养基的150mL锥形瓶中，30℃、200r/min摇床培养48h。

（4）酚含量的测定：采用国家环保总局水质挥发性酚的测定方法，向各发酵液中依次加入0.25mL 20%氨性氯化铵缓冲液、0.5mL 2% 4-氨基安替比林溶液、0.5mL 8%铁氰化钾溶液，混合，放置10min后测其OD510，计算出苯酚降解率，选取苯酚降解率最高的菌株作为筛选的目的菌株。

1.2.3 苯酚降解菌鉴定 （1）菌落形态学：观察平板上菌落的形态特征（颜色、质地、表面状况、边缘状况、形状、隆起程度），并对其进行革兰氏染色[10]。（2）菌落分子鉴定[7，11]：细菌基因组DNA提取根据试剂盒说明书进行，采用细菌通用引物27F（5-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3）及1492R（5-GGTTACCTT GTTACGACTT-3）进行扩增，将PCR扩增后的产物交由生工生物工程（上海）股份有限公司测序，根据所测得序列，将其序列通过NCBI进行BLAST对比分析，并利用MEGA5.0软件构建系统进化树。（3）理化性质：挑取相应菌株到相应平板或发酵液中，进行淀粉水解实验、甲基红试验、V-P反应、柠檬酸盐利用试验、吲哚试验、过氧化氢试验、油脂水解实验、明胶液化实验、糖发酵实验[10，12]。

2 结果与分析

2.1 具苯酚降解能力菌株的筛选结果 样品经初筛之后，得到6株具有苯酚降解能力的菌株，分別命名为L7～L12，对其分别进行复筛培养之后，测得其苯酚降解率如图1所示。由图1可知，在相同培养条件下，6株菌株的苯酚降解率在81%～92%，其中L10的苯酚降解率最低（81.72%），L12的降解率最高（92.25%），所以将L12作为本次实验的目的菌株。

2.2 苯酚降解菌的理化性质 观察苯酚降解菌的菌落特征，可以看出菌落较粘稠、隆起，菌落边缘与中央部位颜色一致，边缘整齐，菌落呈乳白色、圆形，革兰氏染色呈阴性。通过一系列理化实验对L12菌株进行了初步鉴定，理化实验结果如表1所示。

2.3 苯酚降解菌的分子生物学鉴定 将菌株提取基因组DNA后，通过细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增后所得的产物交由生工生物工程（上海）股份测序后，通过与NCBI进行BLAST对比分析，结果表明该菌株与假单胞菌（Pseudmonas sp）有极高的相似度，初步鉴定此菌株为假单胞菌，并利用MEGA5.0软件构建系统进化树，确定其进化地位，结果如图2所示。

3 结论与讨论

研究结果表明，从芦苇内生菌中分离出1株细菌，该菌株呈杆状，革兰氏染色呈阴性，初步鉴定为假单胞菌。植物对苯酚等有害化学物质的修复主要有赖于协同功能微生物的数量和活性，其中细菌是发挥最主要作用的微生物类群。从植物中分离、筛选内生降解苯酚的细菌并研究其特性，对于揭示植物降解苯酚等有害化学物质过程中微生物所扮演的生态角色具有重要意义。

参考文献

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（责编：徐世红）