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四种检测方法在结核病诊断中的比较

2020-08-06周秋菊王冬莲杨阳涂茜石庆新

中国现代医生 2020年16期
关键词:抗酸涂片探针

周秋菊 王冬莲 杨阳 涂茜 石庆新

[摘要] 目的 比較分析MGIT960液体培养法、结核/非结核分枝杆菌核酸检测(PCR-荧光探针法)、Xpert MTB/RIF和直接涂片镜检在结核病诊断中的应用。 方法 收集我院2019年5~12月临床上疑似为结核病患者的各类标本。将疑似结核病患者2天内所有的标本混匀后进行直接涂片镜检,然后平均分装为3份,进行MGIT960液体培养、PCR-荧光探针法和Xpert MTB/RIF。 结果 2019年5~12月间总共收集了我院710份疑似结核病患者的各类标本。直接涂片镜检、PCR-荧光探针法、MGIT960液体培养和Xpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌的阳性率分别为12.0%、18.7%、21.4%和24.8%。以临床诊断作为参考标准时,直接涂片法、PCR-荧光探针法、MGIT960液体培养和Xpert MTB/RIF检出结核分枝杆菌的灵敏度分别为40.2%、60.3%、78.4%和70.1%,而特异度分别为98.6%、96.9%、100.0%和92.2%,且四种方法组间比较均具有统计学差异。 结论 四种临床检测方法在结核病诊断中各有优缺点,联合应用可以更好的诊断、治疗和监测结核病。

[关键词] 结核病;Xpert MTB/RIF;PCR-荧光探针法;MGIT960液体培养法

[中图分类号] R52          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701(2020)16-0008-05

Comparison of four detection methods in the diagnosis of tuberculosis

ZHOU Qiuju   WANG Donglian   YANG Yang   TU Xi   SHI Qingxin

Department of Clinical Laboratory, Enze Hospital, Taizhou Enze Medical Center(Group), Taizhou  318050, China

[Abstract] Objective To compare and analyze the application of MGIT960 liquid culture method, tuberculosis/non-tuberculous nucleic acid detection(PCR-fluorescent probe method), Xpert MTB/RIF and direct smear microscopy in the diagnosis of tuberculosis. Methods Various specimens from clinically suspected tuberculosis patients in our hospital from May to December 2019 were collected. All specimens from suspected tuberculosis patients were mixed in two days, then directly smeared for microscopy, and then divided into three equal parts for MGIT960 liquid culture, PCR-fluorescent probe method and Xpert MTB/RIF. Results A total of 710 specimens of suspected tuberculosis patients were collected from our hospital from May 2019 to December 2019. The positive rates of direct smear microscopy, PCR-fluorescent probe method, MGIT960 liquid culture and Xpert MTB/RIF detection of Mycobacterium tuberculosis were 12.0%, 18.7%, 21.4% and 24.8%, respectively. Taking clinical diagnosis as the reference standard, the sensitivity of detecting Mycobacterium tuberculosis by direct smear method, PCR-fluorescent probe method, MGIT960 liquid culture, and Xpert MTB/RIF was 40.2%, 60.3%, 78.4%, and 70.1%, respectively, and the specificity was 98.6%, 96.9%, 100.0%, and 92.2%, respectively, and the differences were statistically significant. Conclusion The four clinical detection methods have their own advantages and disadvantages in the diagnosis of tuberculosis, and the combined application can better diagnose, treat and monitor tuberculosis.

[Key words] Tuberculosis; Xpert MTB/RIF; PCR-fluorescent probe method; MGIT960 liquid culture method

结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病,是全球死亡人数最多的单一病原体所致的传染病,也是全球十大死因之一。主要通过飞沫传播,可引起肺结核和肺外结核。大约90%为成年人,男女比例为2:1。在全球范围内,2018年估计新发结核病患者约1000万(900~1110万),结核病死亡人数约124万,利福平耐药结核病患者约48.4万,其中耐多药结核病患者约占78%[1]。2015~2018年间结核病的发病率累计降幅为6.3%,死亡率减少了11%[1],远低于《终止结核病策略》的目标,因此终止结核病的任务还是非常艰巨的。为了更多地减少结核病发病率和死亡率,需做好预防外,还需做到早发现早诊断早治疗。目前结核病常用的实验室诊断方法有MGIT960液体培养、Xpert MTB/RIF、结核/非结核分枝杆菌核酸检测(PCR-荧光探针法)和直接涂片镜检检查,通过比较各方法的灵敏度和特异度,为结核病的诊治提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2019年5~12月间我院接诊疑似结核病患者710例,其中男529例,女181例,男女比例为2.9:1,年龄13~91岁,平均年龄(53.5±18.1)岁。收集痰液标本569份,肺泡灌洗液103份,胸水9份,分泌物8份,脓液8份,尿液6份,腹水2份,心包积液2份,腹透液2份,脑脊液1份。结核病患者纳入标准参照结核病分类(WS 196-2017)[2]和肺结核诊断标准(WS 288-2017)[3]。

1.2 试剂和仪器

BACTEC MGIT960全自动分枝杆菌培养监测仪、分枝杆菌MGIT培养管和分枝杆菌培养添加试剂盒均购自于美国BD公司;GeneXpert MTB/RIF仪器及Xpert MTB/RIF检测试剂盒购自于美国Cepheid公司;结核/非结核分枝杆菌核酸检测试剂盒和晶芯Extractor36核酸快速提取儀由北京博奥生物有限公司提供,实时荧光定量PCR仪(型号7300Plus)由美国Applied Biosystems公司提供;抗酸染色试剂由珠海贝索(BASO)生物技术有限公司提供;结核分枝杆菌MPT64抗原由韩国Standard Diagnostics公司提供。

1.3 方法

将疑似结核病患者2天内所有的标本混匀后进行直接涂片镜检,然后平均分装为3份,进行MGIT960液体培养、Xpert MTB/RIF检测和结核/非结核分枝杆菌核酸检测(PCR-荧光探针法)。

1.3.1 直接涂片镜检法  首先准备干净的玻片并做好标本序号标记,用竹签挑取痰标本中干酪样、脓样或血性部分约0.05 mL,于玻片正面均匀涂抹成10 mm×20 mm的卵圆形痰膜,涂片自然干燥后,酒精灯加热固定。然后滴加石碳酸复红染液盖满玻片,染色5 min,流水轻缓冲洗染液,沥水后自痰膜上端外缘滴加脱色剂盖满玻片,脱色1 min,流水冲洗,沥水,最后滴加亚甲蓝复染液,染色30 s,流水轻缓冲洗复染液,沥水,待玻片干燥后镜检。

1.3.2 MGIT960液体培养  严格按照SOP进行操作,首先配制2% NALC-NaOH标本前处理液,往50 mL离心管中加入等量现配标本前处理液消化处理15~20 min后,加无菌PBS(pH6.8)至约50 mL,盖紧盖子,混合后离心3000 g×15 min,去上清,加1~3 mL PBS悬浮沉淀,加0.5 mL悬浮液至提前加入0.8 mL分枝杆菌培养添加剂的MGIT培养管中,上机检测。培养报阳后的标本先进行抗酸染色,抗酸染色阳性的进行结核分枝杆菌MPT64抗原检测。

1.3.3 Xpert MTB/RIF  严格按照SOP进行操作,首先往50 mL离心管中加入等量标本体积的样本前处理液消化处理15~20 min,将处理后的标本加入2 mL到检测匣中,30 min内进行上机检测。通过GeneXpert Dx系统测量的荧光信号和内设的算法来判定结果。

1.3.4 结核/非结核分枝杆菌核酸检测  严格按照SOP进行操作,首先在无菌痰杯内加入等量的4% NaOH溶液对标本进行消化处理30 min,然后取1 mL液体加入1.5 mL EP管中,离心12000 r/min×5 min,去上清后加入50 μL核酸提取液,上机进行核酸快速提取。准备扩增反应液管,每管加入2 μL标本核酸和阴阳性对照品,上机进行PCR扩增。PCR结束后,根据样品的Ct值判断结果。

1.4 统计学方法

采用SPSS23.0统计学软件进行分析。计数资料以例数或率表示,采用χ2检验进行统计学分析,Ρ<0.05为差异有统计学意义。通过阳性率、灵敏度和特异度等指标来比较四种检测方法在结核病诊断中的应用,其中灵敏度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%,特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%。

2 结果

2.1 四种方法检测结核分枝杆菌的阳性率

2019年5~12月间收集了我院710份疑似结核病患者的标本,对其进行MGIT960液体培养、Xpert MTB/RIF、PCR-荧光探针法和直接涂片检查时发现,直接涂片法检出结核分枝杆菌的阳性率最低,Xpert MTB/RIF检出结核分枝杆菌的阳性率最高,四种方法检测结核分枝杆菌的阳性检出率分别为12.0%、18.7%、21.4%和24.8%,且差异有统计学意义,见表1。

2.2 以临床诊断为标准,四种方法检测结核分枝杆菌比较

参照肺结核诊断标准(WS 288-2017)[3],研究发现194例结核病,其中用直接涂片镜检、PCR-荧光探针法、MGIT960液体培养和Xpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌的灵敏度分别为40.2%、60.3%、78.4%和70.1%,对应的特异度分别为98.6%、96.9%、100.0%和92.2%,且差异有统计学意义,见表2。

2.3 四种方法检测结核分枝杆菌组间比较

此外,对直接涂片法、PCR-荧光探针法、液体培养法和Xpert MTB/RIF进行组间比较,结果发现两两方法间存在统计学差异,见表3~5。

3讨论

结核病的临床诊断需要根据临床症状、影像学特征和实验室检查三大方面综合来判断。

目前,结核病的实验室诊断技术主要有细菌学诊断技术、免疫学诊断技术和分子生物学诊断技术。细菌学诊断技术有传统上的显微镜检查(抗酸染色和荧光染色)和分离培养(固体培养法和液体培养法);免疫学诊断技术常见的有T-SPOT、MPT64抗原和结核抗体的检测;分子生物学诊断技术常用的有PCR-荧光探针法、基因芯片法和Xpert MTB/RIF。在本研究中主要是比较分析MGIT960液体培养、PCR-荧光探针法、Xpert MTB/RIF和直接涂片镜检法。直接涂片镜检法是最简单的,一台普通的光学显微镜就可以完成,一般的小医院都可以开展,也是最快速的,抗酸染色20 min就好,问题是敏感度相对较差,据估计,抗酸染色进行痰涂片的敏感度为20%~70%,每毫升痰中至少需要105 cfu分枝杆菌才能为阳性,特异性为95%~98%[4]。通常认为涂片镜检中出现抗酸杆菌的机会与患者痰中杆菌的数量呈正比,如果痰中杆菌的数量小于1000 cfu/mL,涂片发现抗酸杆菌的机会将小于10%[5]。

为了提高灵敏度,建议留取三份不同时间段的痰标本进行涂片,且留取的痰标本的量最好≥5.0 mL[6],或对痰标本进行离心浓缩、漂白剂浓缩等处理[7]。抗酸染色阳性只能说明抗酸杆菌的存在,除了结核分枝杆菌外,还有可能是非结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌及个别的细菌如诺卡菌等。直接涂片法只能证明抗酸杆菌的存在与否,若想进一步证实细菌的死活情况、菌种鉴定及药物敏感性试验等,需要进行分枝杆菌的培养。培养法是诊断结核病的金标准,检测结核分枝杆菌的敏感性为95%,特异性为98%[4],在培养法中,痰中最少的分枝杆菌的数量可低至102 cfu,与抗酸染色相比具有非常高的敏感性[4]。局限性在于固体培养的时间长,一般需要6~8周,为了缩短时间,临床上常使用的是快速培养法,我们研究中所用到的BACTEC MGIT960系统是全自动的,可连续监测分枝杆菌生长的情况,平均13.2 d报阳,大大缩短了培养时间[8]。据报道,BACTEC MGIT960和固体培养的污染率分别为5.0%和2.7%,与固体培养比较,液体培养的污染率高[9]。液体培养法报阳说明有分枝杆菌生长,经抗酸染色验证后,需要使用PNB/TCH、MPT64、MALDI-TOF MS和分子生物学方法对其进行分枝杆菌的菌种鉴定和药敏试验,也可以对其进行菌种保存用于复查或科研。随着分子生物技术的快速发展,越来越多的新方法用于结核病的辅助诊断。Xpert MTB/RIF是一种基于核酸扩增的分子生物学诊断技术,可在2 h内检测是否为结核分枝杆菌复合群及是否对利福平耐药。Xpert MTB/RIF通过检测结核分枝杆菌rpoB基因的利福平抗性决定区域(RRDR)的突变来判定RIF耐药性。据统计,大约95%的利福平耐药结核病例在该81 bp区域中存在突变[10]。Xpert MTB/RIF是一个独立的,完全集成并自动化进行样本纯化、核酸扩增、单一或复杂样品中目标核酸序列检测的技术,具有操作简单、快速、交叉污染低、安全等特点。Xpert MTB/RIF检出结核分枝杆菌的最小值为131cfu/mL,不同于分枝杆菌液体培养的检出限(约10~50 cfu/mL)和涂片显微镜的检出限(约104 cfu/mL)[11],因此,Xpert MTB/RIF分析的灵敏度比涂片显微镜的灵敏度大约高两个数量级,类似于固体培养,但不如液体培养敏感。Zong K等[12]通过meta分析得出Xpert MTB/RIF诊断结核病的总敏感性为93.0%,特异性为98.0%,灵敏度高于直接涂片法,略低于培养法,特异性和培养法差异不大。Xpert MTB/RIF在肺外结核病诊断中也具有较好的检测能力,Vadwai V等[13]发现Xpert MTB/RIF对脓液、滑膜液、心包液和腹膜液等标本具有良好的敏感性(86%~100%),对淋巴结组织和胸水等具有中度敏感性(63%~73%),但对脑脊液的敏感性较差(29%)。另外有一篇报道Xpert MTB/RIF在淋巴结标本的敏感性最高(90%;95%CI:86~94),脑脊液敏感性中等(53%;95%CI:28~79),而腹膜液的敏感性較低(32%;95%CI:12~51),胸膜液的敏感性最低(30%;95%CI:17~44)[14],这种不一致的结果可能与取材的质量和标本例数有关。Xpert MTB/RIF不足之处主要有无法区分活性菌和死亡菌,因此不能用于监测对治疗的反应、治疗成功、治疗失败或复发;无法区分结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和卡介苗;昂贵;需要定期校准和维护等。另外,大约5%的利福平耐药性不是由rpoB核心区域内的基因突变所致,因此Xpert MTB/RIF检测利福平的耐药性时会出现约5%的假阴性[10]。PCR-荧光探针法也是一种分子生物学诊断技术,采用实时定量PCR与荧光杂交探针相结合,对分枝杆菌进行定性检测,可以用于区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌,操作相对简单,检测速度相对较快,只需半天时间即可完成,检测灵敏度50.3%,特异性98.9%,和抗酸染色比较,灵敏度有所提高[15]。非结核分枝杆菌和结核分枝杆菌同归类于分枝杆菌属,在细菌形态学上很难区分,培养法所需的时间长且需要借助其他的生化或免疫方法加以区分,加上近年来非结核分枝杆菌的分离率和患病率呈上升趋势,每年估计上升2.5%~8%[16],为了快速的检测和区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌,临床上建议先用PCR-荧光探针法对分枝杆菌进行初步鉴定。PCR-荧光探针法的局限性主要有不能区分活性分枝杆菌和死亡分枝杆菌;不能用于区分鉴定非结核分枝杆菌;结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌混合生长时,只能报告结核分枝杆菌核酸检测阳性;如果引物、探针设计区段出现新的突变,可能造成假阴性的结果。尽管分子生物学和免疫学的诊断技术得到了一定的发展,但细菌学诊断技术(涂片显微镜检查和分离培养)仍是诊断结核病的金标准,尤其是不发达国家和地区,细菌学方法是唯一的可行性技术。

結核病患者可分为初治和复治,初治患者会先选用2HRZE/4HR方案治疗6个月,在服药满2、5、6个月时进行涂片和培养的复查,而复治肺结核患者会在服药满2、5、8个月时进行复查。耐药结核病患者会在注射期间每个月复查1次,非注射期间每2个月复查1次。我们医院作为耐药结核病诊治的定点医院,每个月都会接诊上百例耐药结核病患者。经统计,MGIT液体培养阳性的152例标本中,有53例耐药结核病,耐药率为34.9%,低于2010年全国结核病流调结果中的42.1%[17],说明诊治有效。研究发现4种方法中Xpert MTB/RIF检出结核分枝杆菌的阳性率最高,而理论上液体培养法的检出限最低,液体培养法检出结核分枝杆菌的阳性率应该最高,出现这种矛盾的结果与Xpert MTB/RIF不能区分活性菌和死亡菌有关。肺结核患者经过早期联合适量规律的合理治疗后,结核分枝杆菌被抑制或被杀灭,液体培养法为阴性时,Xpert MTB/RIF可能还检出极少量的死亡菌株。因此,Xpert MTB/RIF不能用于结核病治疗的监测。直接涂片法检出结核分枝杆菌的阳性率最低,与直接涂片法的检出限高,需要较多的分枝杆菌时才会出现阳性有关。PCR-荧光探针法和Xpert MTB/RIF为分子生物学诊断技术,通过PCR对结核分枝杆菌核酸进行扩增后,灵敏度大幅提高。以临床诊断作为参考标准,我们发现直接涂片法的灵敏度为40.2%,低于Vadwai V等[13]研究中的51%,高于Al-Ateah SM等[18]报道的33.3%和Malbruny B等[19]报道的28.6%,远低于Habous M等[20]报道的67.31%。PCR-荧光探针法的灵敏度为60.3%,高于梁建琴等[15]报道的50.3%,低于梁雪妮等[21]报道的87.5%。液体培养法的灵敏度为78.4%,低于Azadi D等[4]报道的95%。Xpert MTB/RIF的灵敏度为70.1%,低于Vadwai V等[13]报道的83%和Al-Ateah SM等[18]报道的94.4%。我们研究中液体培养法和Xpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌的灵敏度相对较低,可能与疑似结核病患者中诊断为结核病的例数较少有关。总体上,液体培养法的灵敏度最高,其次为Xpert MTB/RIF,最低的为直接涂片法;特异性最高的为液体培养法,其次为直接涂片法,因此Xpert MTB/RIF联合直接涂片法、Xpert MTB/RIF可以快速准确的诊断结核病,液体培养法可以对结核病的治疗进行临床指导和评价,PCR-荧光探针法可以快速有效的鉴别MTB和NTM。

由于直接涂片法的灵敏度较差,培养法的周期较长,临床上更多的依赖于分子生物学的快速检测,Xpert MTB/RIF具有较高的灵敏度和特异度,能准确的诊断结核,还能判断利福平是否耐药,应用越来越多。分子生物学诊断技术的不足在于不能区分活性菌和死亡菌,不能用于结核病治疗的监测。针对这个问题,研究人员正在尝试着开发一个新的方案,通过对痰标本进行预处理,防止非活性结核分枝杆菌中的DNA被扩增。还有正在评估的一个替代方法,将DNA检测改为RNA检测。通过全人类的不断努力,相信未来会真正的实现和完成《终止结核病策略》的目标。

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(收稿日期:2020-01-07)

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