基于石墨烯和金纳米棒的电化学核酸适配体传感器同时检测赭曲霉毒素A和伏马菌素B1

梁秀俊，冯 硕，卫 敏，卫 伟

(1.河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001；2.东南大学 化学化工学院，江苏 南京 211189)

真菌毒素是由真菌产生的次级代谢产物，多产生于粮食谷物的生长、运输及储藏过程中并对其造成严重的污染[1]。真菌毒素具有较强的致癌作用、致畸作用、遗传毒性、免疫毒性和细胞毒性，可损害肝脏、肾脏、神经组织、造血组织及皮肤组织等，对食品安全及人体健康造成严重威胁[2-3]。此外，多种真菌毒素同时存在产生的加成效应使其毒性增强，已经引起世界各国的关注[4-6]。作为常见的真菌毒素，赭曲霉毒素 A(OTA)和伏马菌素 B1(FB1)可能共存于玉米、小麦、啤酒和饲料等农作物及其制品中，通过食物链对人类健康造成危害。因此，建立灵敏、快速、经济且准确的 OTA 和 FB1同时检测方法具有重要意义。

在目前的真菌毒素检测方法中，电化学核酸适配体传感器因操作简便、选择性高、仪器小型、易于实现现场检测等优势而成为研究热点[7-8]。由于OTA和FB1的存在多为痕量级，借助纳米材料实现信号放大以提高电化学核酸适配体传感器的灵敏度受到广泛关注。石墨烯(GR)具有生物相容性好、导电性强、比表面积大、能够通过π-π相互作用吸附单链DNA等优点，被用于电化学生物传感器的构建[9-10]。另一方面，金纳米棒(AuNRs)因导电性强、生物相容性好、对巯基修饰的物质具有高吸附能力等优点而被广泛用于信号放大策略的设计[11-12]。

本文中，笔者制备AuNRs作为核酸适配体和信号探针的固定载体，利用GR修饰电极吸附单链DNA，构建新型电化学核酸适配体传感器用于OTA和FB1的同时检测研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

OTA的核酸适配体(Apt1)5′-SH-G￣A￣T￣C￣G￣G￣G￣T￣G￣T￣G￣G￣G￣T￣G￣G￣C￣G￣T￣A￣A￣A￣G￣G￣G￣A￣G￣C￣A￣T￣C￣G￣G￣A￣C￣A-3′和FB1的核酸适配体(Apt2)5′-SH-A￣T￣A￣C￣C￣A￣G￣C￣T￣T￣A￣T￣T￣C￣A￣A￣T￣T￣A￣A￣T￣C￣G￣C￣A￣T￣T￣A￣C￣C￣T￣T￣A￣T￣A￣C￣C￣A￣G￣C￣T￣T￣A￣T￣T￣C￣A￣A￣T￣T￣A￣C￣G￣T￣C￣T￣G￣C￣A￣C￣A￣T￣A￣C￣C￣A￣G￣C￣T￣T￣A￣T￣T￣C￣A￣A￣G￣T￣A￣G￣A￣T￣A￣G￣T￣A￣A￣G￣T￣G￣C￣A￣A￣T￣C￣T-3′，生物工程(上海)股份有限公司；OTA、FB1、黄曲霉毒素B1(AFB1)和玉米赤霉烯酮(ZEA)，Sigma-Aldrich公司；巯基二茂铁(Fc-SH)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硫堇(Th)，天津市科密欧化学试剂有限公司；石墨烯，郑州时代纳米生物技术有限公司；其余所使用的化学试剂均为市售分析纯。

CHI 660E型电化学工作站，上海辰华仪器有限公司。交流阻抗参数设置：电位0.19 V，扫描速率5 mV/s，扫描范围0.1 Hz～10 kHz。差分脉冲参数设置：扫描区间-0.4～0.6 V，扫描速率50 mV/s。所制备材料用扫描电子显微镜(JSM-7610F，日本电子株式会社)进行表征。

1.2 方法

1.2.1 Apt1-AuNRs-Th和Apt2-AuNRs-Fc的制备

将5 mg/mL Th和0.1 mol/L Fc-SH加至制备好的AuNRs溶液中振荡2 h，离心后分别加入2 μmol/L Apt1和Apt2，继续振荡孵育2 h。离心后加入0.5% 牛血清白蛋白(BSA)振荡孵育40 min。离心后加入适量的Tris-HCl缓冲液得到Apt1-AuNRs-Th和Apt2-AuNRs-Fc。

1.2.2 Apt2-AuNRs-Fc&Apt1-AuNRs-Th/GR-CS/AuE传感器制备

在清洗、活化过的金电极(AuE)表面滴加5 μL配制好的石墨烯-壳聚糖(GR-CS)溶液，得到GR-CS/AuE。滴加5 μL BSA至电极表面，37 ℃孵育1 h后用 Tris-HCl缓冲液洗去多余的BSA。然后滴加5 μL Apt1-AuNRs-Th和Apt2-AuNRs-Fc至电极表面，37 ℃孵育2 h后用Tris-HCl缓冲液冲洗，得到Apt2-AuNRs-Fc&Apt1-AuNRs-Th/GR-CS/AuE传感器。

图1为Apt2-AuNRs-Fc&Apt1-AuNRs-Th/GR-CS/AuE传感器检测原理图。当毒素不存在时，GR和AuNRs双重信号放大作用使得电极表面信号探针Th和Fc产生大的电流信号；当毒素存在时，Apt与其对应的毒素形成复合物并从电极表面脱落，电极表面的Th和Fc减少，对应的电流信号降低。依据加入毒素前后产生的电流变化，可以实现对OTA和FB1的同时检测。

图1 基于Apt2-AuNRs-Fc&Apt1-AuNRs-Th/GR-CS/AuE传感器的检测原理

2 结果与讨论

2.1 Apt2-AuNRs-Fc&Apt1-AuNRs-Th/GR-CS/AuE传感器表征

利用扫描电镜(SEM)对GR和Apt2-AuNRs-Fc&Apt1-AuNRs-Th/GR进行形貌表征的结果见图2。由图2可以看出，GR的薄层状结构清晰明显(图2(a))，表面存在褶皱；而当AuNRs成功被GR吸附，则在GR的表面出现大量点状物(图2(b))。

图2 GR和Apt2-AuNRs-Fc&Apt1-AuNRs-Th/GR的扫描电镜

用交流阻抗对传感器的制备过程进行表征，结果如图3所示。由图3可知：AuE(a)和GR-CS/AuE(b)的阻抗值分别为136.2和40.1 Ω，说明GR良好的导电性能促进了电极表面的电子转移；BSA封闭GR-CS/AuE(c)的阻抗值增大至104 Ω。先后加入Apt1-AuNRs-Th和Apt2-AuNRs-Fc，虽然电极表面负载的AuNRs具有较好的促进电子转移能力，但是单链DNA会排斥带负电荷的[Fe(CN)6]3-/4-。因此，Apt1-AuNRs-Th/GR-CS/AuE(d)和Apt2-AuNRs-Fc&Apt1-AuNRs-Th/GR-CS/AuE(e)的阻抗值分别增至247.4和368.3 Ω。图2和图3的结果表明，Apt2-AuNRs-Fc&Apt1-AuNRs-Th/GR-CS/AuE传感器制备成功。

图3 不同电极在5 mmol/L K3[Fe(CN)6](含0.10 mol/L KCl)溶液中的交流阻抗

2.2 Apt2-AuNRs-Fc&Apt1-AuNRs-Th/GR-CS/AuE传感器同时检测OTA和FB1

图4为Apt2-AuNRs-Fc&Apt1-AuNRs-Th/GR-CS/AuE传感器同时检测在50 mmol/L 的Tris-HCl溶液中的OTA和FB1的差分脉冲曲线。

图4 Apt2-AuNRs-Fc&Apt1-AuNRs-Th/GR-CS/AuE传感器孵育 0.1 ng/mL OTA和FB1前(a)、后(b)在50 mmol/L 的Tris-HCl溶液中的差分脉冲曲线

由图4可知：未加入OTA和FB1(a)时，Apt2-AuNRs-Fc&Apt1-AuNRs-Th/GR-CS/AuE传感器上Th和Fc产生的峰电流值分别为299.3和314.8 μΑ；当加入0.1 ng/mL OTA和FB1(b)后，Th和Fc产生的峰电流值分别降低至184.5和186.1 μΑ，推断是因为OTA和FB1与其对应的Apt结合，使Apt的构象发生变化，导致Apt1-AuNRs-Th和Apt2-AuNRs-Fc从电极上脱落，电极表面信号探针Th和Fc减少。Th和Fc产生的峰电流变化与加入目标物的量相关，从而实现OTA和FB1的同时检测。

进一步研究OTA和FB1加入前后Th和Fc峰电流变化(ΔI)与浓度的对应关系，结果如图5所示。

图5 不同浓度OTA和FB1对应的差分脉冲曲线(a)及其与ΔI的关系(b)

由图5可知，随着OTA和FB1浓度增大，Th和Fc对应的ΔI也逐渐增大。在5×10-4～1×103ng/mL范围内，Th和Fc的峰电流值与lg C呈线性相关(图5(b))，线性方程分别为ΔI1=31.22 lgCOTA+144.08(R2=0.998)和ΔI2=34.02 lgCFB1+162.72(R2=0.998)，OTA和FB1检出限分别为 0.34和0.17 pg/mL。所制备传感器的检出限与文献报道的电化学传感器比较如表1所示。

由表1可知，制备的传感器具有较宽的线性范围和较低的检出限。与文献[12]相比，该传感器可以省去作为固定核酸适配体载体的互补链，不仅能够节约实验材料、降低实验成本，还可以减少传感器的制备时间。

表1 不同电化学传感器检测OTA及FB1的结果比较

2.3 Apt2-AuNRs-Fc&Apt1-AuNRs-Th/GR-CS/AuE传感器性能

考察传感器对AFB1和ZEA的抗干扰性能，结果如图6所示。

图6 不同毒素对传感器特异性的影响(OTA和 FB1：0.1 ng/mL；ZEA 和AFB1：5 ng/mL)

由图6可以看出，只有当OTA和FB1分别单独存在时，Th和Fc的峰电流明显降低，说明该传感器具有良好的特异性。

对相同条件下制备的5个传感器进行测定，得到Th和Fc峰电流的相对标准偏差(RSD)分别为6.47%和7.18%，说明制备的传感器具有可接受的重现性。对同一传感器进行5次重复测量，Th和Fc峰电流的RSD分别为5.19%和6.41%，说明制备的传感器具有可接受的重复性。

2.4 实际样品检测结果

对啤酒样品进行N2吹除去其泡沫后，加入适量OTA和FB1的标准母液，并用Tris-HCl缓冲液稀释，使OTA和FB1的3个梯度质量浓度分别为1×10-3、1.0和500 ng/mL。利用制备的传感器对加标啤酒进行检测，结果见表2。

表2 啤酒样品中OTA和FB1的检测(n=3)

由表2可知，OTA和FB1的平均回收率为 94.1%～97.7%和 87.1%～95.3%，表明该传感器可用于实际样品的检测。

3 结论

利用GR制备新型Apt2-AuNRs-Fc&Apt1-AuNRs-Th/GR-CS/AuE传感器用于OTA和FB1的同时检测，得到检出限分别为0.34和0.17 pg/mL。该传感器具有良好的特异性、较好的重复性和重现性、可接受的样品检测回收率，为进一步开发灵敏度高、选择性好、用于现场检测真菌毒素的方法奠定了基础，可作为保障我国食品安全的一种有效的技术手段。