2种罗丹明-多环芳烃聚苯乙烯固相传感器检测Hg2+的荧光差异

李 爽，熊金恩，文湘郡，李 壹，卢一辰，熊 雄，刘元建，熊晓辉

(南京工业大学 食品与轻工学院，江苏 南京 211800)

汞离子(Hg2+)对哺乳动物细胞具有高毒性[1-4]，作为不可生物降解的持久性污染物，其可以长期保留在生态系统中[5-7]。近年来，越来越多的生物荧光传感器[8-9]、纳米材料荧光传感器[10]和化学荧光探针[11-14]被开发出来用于汞离子的检测，它们具有操作简便、灵敏度高、选择性强、检测时间短等优点。但是，这些传感器不适用于目标物的富集、分离和去除，并且难以回收利用。因此，经济、环保的固相荧光传感器的设计与合成已成为当前研究热点。它们通常由两部分组成：①固相载体；②包含识别基团、连接臂和发光基团的小分子荧光探针。

罗丹明是一种荧光染料，具有荧光量子效率高和吸收系数大的特点[15-17]，而且可作为识别Hg2+的荧光探针，其作用原理：当没有Hg2+时，罗丹明B内酰胺以闭环形式存在且不发荧光；当加入Hg2+后酰胺键断裂，结构开环，荧光强度显著增强，从而实现选择性识别Hg2+。因此其可作为检测Hg2+的理想探针[18-20]。另外，聚苯乙烯微球具有比表面积大、性能稳定以及吸收和表面反应能力强等优点，已广泛用于色谱分离、酶固定和生物传感器中[21-23]。在笔者之前的工作中，开发了一种基于罗丹明的聚苯乙烯荧光传感器Ⅰ，其对Hg2+的测定检测限低0.439 μmol/L[24]。它具有很高的灵敏度和选择性，同时获得了良好的重现性和稳定性，可用于检测实际样品中的Hg2+。但是，就像大多数基于罗丹明的传感器一样，Hg2+与其他金属离子(例如Cu2+、Pb2+和Cd2+)之间也存在竞争性选择性[25-26]，这在某种程度上影响了其应用效果。

芘和萘是多环芳烃(PAHs)的两个出色代表，具有强大而稳定的光化学性能。作为形成折叠和π-堆叠构象的最有效的荧光团，它们通常用于分子传感。特别是，芘单体和准分子的荧光发射可产生更大的斯托克斯位移(>60 nm)，比其他任何荧光团都要好[27-28]。因此，可以通过控制单体和准分子的转化率来设计比率型荧光探针，以实现金属离子的识别。本文中，笔者在继续对检测限较低的新型聚苯乙烯固相荧光传感器进行研究的基础上，开发了2种新型罗丹明-PAHs传感器PS-RB-2和PS-R6G-2，其中氯甲基聚苯乙烯微球为载体，芘或萘为荧光团，用于检测Hg2+；同时对它们的结构-荧光关系进行探讨，并且将其与笔者先前报道的传感器Ⅰ[24]进行比较，基于晶体结构从理论层面探讨检测机制。值得关注的是，笔者不仅将PS-RB-2用于实际样品中Hg2+的测定，而且还将其开发用于固相萃取柱，通过观察明显的颜色变化快速检测Hg2+。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

采用四甲基硅烷(TMS)作为内标，在CDCl3溶剂中使用BrukerAV-400型光谱仪进行核磁共振(NMR)检测。使用Thermo Nicolet 380型红外光谱分析仪(FT-IR)，用KBr压片法记录红外(IR)光谱。在Thermo TSQ Quantum Access MAX质谱仪上进行质谱分析。元素分析使用FlashEA-1112型元素分析仪。在Shimadzu RF-5301PC型荧光光谱仪上，使用直径为1 cm的比色皿在室温下进行荧光光谱分析，狭缝宽度设置为5 nm。除另有说明外，所有试剂均来自南京晚晴化玻仪器有限公司。Ca2+、Na+、K+、Ni2+、Pb2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Ag+、Cd2+、Fe2+、Cr3+和Ba2+从各自氯化物或硝酸盐中获得。

1.2 合成化合物RB-1和R6G-1

参照文献[29]合成了化合物RB-1，根据文献[30]的方法制备化合物R6G-1。

1.3 化合物RB-2和R6G-2的合成

在N2保护下将化合物RB-1或R6G-1(1 mmol)和1-芘甲醛或1-萘甲醛(1 mmol)溶解在乙醇(100 mL)中，然后将混合物回流24 h。通过硅胶色谱柱层析(AcOEt/石油醚，体积比1∶ 4)对粗产物进行过滤纯化，得到黄色固体RB-2(0.48 g，产率72%)或R6G-2(0.43 g，产率75%)。

(E)-3′,6′-双(二乙氨基)-2-((吡啶-1基亚甲基)氨基)螺[异吲哚啉-1,9′-黄嘌呤]-3-1(RB-2)。1H NMR(CDCl3，400 MHz)：δ9.60(s，1H，CH)，δ8.52(d，J=8.0 Hz，1H，ArH)，δ8.11(m，9H，ArH)，δ7.53(m，2H，ArH)，δ7.20(d，J=6.8 Hz，1H，ArH)，δ6.64(d，J=8.8 Hz，2H，ArH)，δ6.55(d，J=2.4 Hz，2H，ArH)，δ6.28(q，J=2.4 Hz，2H，ArH)，δ3.32(q，J=7.0Hz，8H，CH2)，δ1.14(t，12H，J=7.0Hz，CH3)。

ESI-MS分析。C45H40N4O2的计算值[M+H]+为669.32，实测值为669.33。对于C45H40N4O2：C 80.81，H 6.03，N 8.38；实测值为C 80.55，H 6.06，N 8.43。

(E)-3′,6′-双(乙基氨基)-2′，7′-二甲基-2-((萘-1-基亚甲基)氨基)螺[异吲哚啉-1,9′-黄嘌呤]-3-1(R6G-2)。1H NMR(CDCl3，400 MHz)：δ9.36(s，1H，CH)，δ8.03(q，J=1.6 Hz，2H，ArH)，δ7.88(d，J=6.8 Hz，1H，ArH)，δ7.77(t，J=1.6 Hz，2H，ArH)，δ7.50(m，2H，ArH)，δ7.40(m，3H，ArH)，δ7.17(t，J=1.6 Hz，1H，ArH)，δ6.54(s，2H，ArH)，δ6.26(s，2H，ArH)，δ3.31(q，J=7.2 Hz，4H，CH2)，δ1.82(s，6H，CH3)，δ1.25(t，J=7.2 Hz，6H，CH3)。

ESI-MS分析。C37H34N4O2[M+H]+的计算值为567.27，实测值为567.26。对于C37H34N4O2：C 78.42，H 6.05，N 9.89；实测值为C 78.66，H 6.02，N 9.85。

1.4 传感器PS-RB-2和PS-R6G-2的制备

将氯甲基聚苯乙烯微球PS-Cl(0.2 g)在干燥的DMSO(30 mL)中溶胀过夜，然后加入化合物RB-2(0.67 g，1 mmol)或R6G-2(0.57 g，1 mmol)和三乙胺(0.1 g，1 mmol)。将反应混合物在60 ℃下搅拌24 h，然后过滤。粗微球用甲醇的索氏提取法纯化24 h，然后在30 ℃下真空干燥24 h，得到传感器PS-RB-2(0.23 g)或PS-R6G-2(0.25 g)。

1.5 X线衍射晶体学

通过在室温下缓慢蒸发甲醇溶液，可获得合适的RB-2和R6G-2晶体。在293 K上使用ω-2θ扫描模式，在具有Mo-Kα辐射(0.071 073 nm)的Nonius CAD-4衍射仪上收集晶体数据。使用SHELXS-97直接解析结构，并使用SHELXL-97[31]通过全矩阵最小二乘法在F2上对所有数据进行平方运算。所有非H-原子均按各向异性进行细化，将H原子添加到计算出的位置并使用骑乘模型精炼。各向同性温度系数固定为H原子所连接的C原子的等效各向同性位移参数的1.2倍(Me为1.5倍)。CCDC-1874778(RB-2)和CCDC-1874772(R6G-2)包含本文的补充晶体学数据。这些数据可通过http://www.ccdc.cam.ac.uk/conts/retrieving.html免费获得(或Cambridge Crystallographic Data Centre,12,Union Road,Cambridge CB2 1EZ,UK; fax:+441223336033)。

1.6 金属离子选择性

用乙腈(200 μL)溶胀PS-RB-2或PS-R6G-2(2 mg)，然后加入10 μL(80 μmol/L)Hg2+。分别加入10 μL(80 μmol/L)的Ca2+、Na+、K+、Ni2+、Pb2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Ag+、Cd2+、Fe2+、Cr3+和Ba2+后，在540 nm处激发测定荧光强度。

1.7 传感器回收利用

相比于传感器，乙二胺四乙酸(EDTA)与Hg2+具有更强的螯合作用，可导致荧光消失，并且传感器恢复闭环不会影响其再次使用。基于此，笔者验证了所设计的传感器的重复利用效果，向结合Hg2+后的传感体系中逐渐滴加EDTA，直至体系荧光强度恢复到初始值。重复Hg2+荧光滴定和EDTA络合滴定步骤，并记录每次的最高和最低荧光值。

1.8 实际样品溶液的制备

从南京工业大学江浦校区获得自来水和环境湖水，使用0.22 μm膜过滤[32]。从超市购买鲫鱼样品，称质量后放入消化罐中，然后加入浓硝酸(8 mL)。样品在120 ℃下加热1 h，冷却后暴露于微波消解系统中，直至完全消解。将得到的溶液在120 ℃下加热以除去酸。过滤消化液后，用1 μmol/L NaOH溶液将上清液的pH调至6～7[33]。

2 结果与讨论

2.1 合成与表征结果

图1 RB-2和R6G-2的晶体结构

图2 PS-Cl，PS-RB-2和PS-R6G-2的FT-IR光谱

通过扫描电子显微镜(SEM)分析了PS-Cl、PS-RB-2和PS-R6G-2的形态和结构，结果如图3所示。由图3可见，所有微球均保持良好的球形度和单分散性，形态无明显变化。但是，从低放大倍数图中(×300、×500)可以看出，相比较于PS-Cl、PS-RB-2及PS-R6G-2传感器表面明显更加粗糙，而且更高放大倍数(×2 000,×1 600)的表面电镜图也证实了此结论。表面形态的明显变化表明固载成功。

图3 PS-Cl、PS-RB-2和PS-R6G-2的SEM

2.2 荧光性质

为了探索传感器检测特性，用Hg2+对PS-RB-2和PS-R6G-2进行了荧光滴定。由笔者之前的研究可知[24]，在4 min内完成识别，在pH为6.0～9.0时荧光变化可忽略不计。逐步添加Hg2+后，在574 nm处观察到增强的荧光发射(图4)。对于PS-RB-2，Hg2+的线性浓度方程为y=63.42x+29.39(R2=0.995 9)；对于PS-R6G-2，Hg2+的线性浓度方程为y=58.13x+30.73(R2=0.996)。根据3s/k将检测限确定为0.072 μmol/L，其中s为标准偏差，k为校正图的斜率[38-39]。但是，与之相比，传感器PS-RB-2表现出更高的荧光响应和更低的检测限0.065 μmol/L，也优于传感器Ⅰ[24]。此外，加入Hg2+后，微球表面的颜色从黄色变为玫瑰红色，这说明传感器可以实现荧光“开关”响应和视觉识别Hg2+。

图4 传感器PS-RB-2(a)和PS-R6G-2(b)在乙腈中的荧光滴定光谱(激发波长为540 nm)

图5为加入Ca2+、Na+、K+、Ni2+、Pb2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Ag+、Cd2+、Fe2+、Cr3+和Ba2+后观察到弱的荧光增强作用(黑条)。由图5可知，当添加Hg2+离子时，观察到明显的变化(红色条)。与PS-R6G-2相比，PS-RB-2对Hg2+具有更好的选择性和荧光响应，并且具有明显的颜色变化，从黄色到玫瑰红，而其他离子保持黄色。它对Cu2+的抗干扰能力也优于传感器Ⅰ[24]。从其他金属离子的选择性来看，PS-RB-2具有与传感器Ⅰ相似的性能。

图5 PS-RB-2(a)和PS-R6G-2(b)对乙腈中各种金属离子的荧光响应

2.3 检测机制

PS-RB-2和PS-R6G-2与Hg2+的检测机制如图6所示。由图6可知，一开始，罗丹明是以闭环形式存在，不发出明显的荧光。通过添加Hg2+后，PS-RB-2和PS-R6G-2可以通过N和O原子与Hg2+螯合，从而导致闭环打开，并在574 nm处出现明显的颜色变化和强烈的荧光发射。

图6 PS-RB-2和PS-R6G-2对Hg2+的检测机制

此外，采用EDTA滴定探索了传感器的重复使用性能，EDTA(10 μmol/L)与Hg2+(4 μmol/L)溶液交替处理后的螯合作用更强，可导致荧光消失，并且传感器恢复闭环，结果如图7所示。由图7可知，PS-RB-2和PS-R6G-2在乙腈中可重复使用3次以上。然而，随着重复时间的增加，荧光强度会降低，这可能是由于一些罗丹明衍生物在聚苯乙烯微球表面的损失。另外，表面颜色在重复使用的过程中不断变化，表明固载在微球上的罗丹明呈“开-关”状态。

图7 Hg2+(4 μmol/L)和EDTA(10 μmol/L)溶液交替处理后PS-RB-2(a)和PS-R6G-2(b)的荧光强度变化

为了探索不同聚苯乙烯微球对传感器的影响，将PS-RB-2和PS-R6G-2的分析性能与传感器Ⅰ[24]进行了比较。传感器Ⅰ采用氯乙酰化聚苯乙烯微球(200 μm)作为载体，罗丹明RH作为识别探针，结果如表1所示。由表1可知，具有较小尺寸的PS-RB-2和PS-R6G-2具有较低的检测极限，而诸如响应时间、选择性和可回收性的其他性质没有减弱。尺寸的减小可以增加比表面积和负载量。此外，由于氯乙酰基更大的活力，氯乙酰化的微球稳定性低于氯甲基微球。在氯乙酰化微球的合成过程中，还会发生其他副反应，会减少Cl的含量，进而降低了微球负载率。另外，PS-RB-2和PS-R6G-2可以在室温条件下使用，没有特殊条件，操作相对简单。与某些Hg2+化学传感器相比[13-14]，尽管它们检测限低、选择性好，但重复使用性差限制了它们的大规模应用。在固相载体(如聚苯乙烯微球)上修饰小分子荧光探针可以解决此问题。但是，引入较大尺寸的载体可能会降低其检测性能，例如检出限。因此，笔者选择较小尺寸的氯甲基微球作为载体，得到了具有良好的检测和重复使用性能的固相传感器PS-RB-2和PS-R6G-2。PS-RB-2和PS-R6G-2对Hg2+的选择性高、成本节约、可回收利用对环境友好，这使得在检测真实样品种具有非常好的应用前景。

表1 3种传感器的分析性能比较

2.4 与传统方法的比较

与一些传统的无荧光化学传感器方法相比较，本工作中的方法具有更低的检出限，结果如表2所示。与传统的仪器分析法相比较，虽然检出限不如仪器分析法低，但本方法更加省时，成本低，且可以重复利用，这进一步证实了本固相荧光传感器的优异性。

表2 与传统方法的比较

3 应用

将传感器PS-RB-2用于实际样本的检测证实其可靠性和实用性。分别测定了自来水、湖水和鲫鱼中的Hg2+。通过标准添加方法对所有样品进行分析，这些方法是根据环境水和鱼类中可能存在的金属离子制备的，并采用所建立的方法进行分析，结果见表3。

表3 实际样品中Hg2+的加标回收结果(n=3)

从表3可以看出，自来水、湖水和鲫鱼的回收率分别为92.60～105.80%、98.45～106.10%和91.30～105.84%，加标回收率研究的相对误差低于10%。这表明分析结果在可接受的范围内。因此，建立的方法简便、快速、环境友好且可靠，证实其可用于实际水和食品样品中Hg2+的检测。

值得注意的是，这些传感器是可重复利用的。Hg2+的失去可使它们恢复到以前的状态。此外，笔者还开发了简单的PS-RB-2填充的固相萃取柱(图8)，并用其快速分析乙腈中Hg2+的浓度。填充层最初为浅黄色，当10 mg/L Hg2+缓慢流动时变为红色。更重要的是，当使用EDTA流动数次后，它变成浅黄色。此循环过程至少可以重复3次。

A—只有PS-RB-2；B—10 mg/L Hg2+流入A柱；C—EDTA几次流经C柱；D—10 mg/L Hg2+穿过C柱

4 结论

笔者开发了一种基于罗丹明-PAHs衍生物和聚苯乙烯微球的Hg2+检测方法。通过将芘或萘荧光团引入聚苯乙烯微球，可以合成2个新型的固相荧光传感器PS-RB-2和PS-R6G-2，并获得了较低的检测限(PS-RB-2为0.065 μmol/L)。提出了基于Hg2+螯合诱导罗丹明螺内酰胺开环的传感机制，并在理论层面基于晶体结构进行了探讨。PS-RB-2传感器已成功应用于自来水、湖水和鲫鱼样品中的Hg2+监测。最后，开发了基于PS-RB-2的固相萃取柱，通过观察颜色变化(从黄色到玫瑰红)来快速检测Hg2+。PS-RB-2可实现对Hg2+高选择性、瞬时响应、良好的抗干扰性以及可回收性，使其成为非常具有应用潜力的固相荧光传感器，可以进一步监测环境样品中的Hg2+。