响应面法优化顶头孢霉发酵稻草秸秆产头孢菌素C的培养基

2020-08-06陈家丽姚日生余婉蓉詹进锁朱慧霞

中国酿造 2020年7期

陈家丽，姚日生，余婉蓉，詹进锁，朱慧霞，王淮

（合肥工业大学食品与生物工程学院，安徽合肥 230601）

廉价易得的培养基原料是生物发酵行业一直以来孜孜以求的目标。作为全球最大的谷物生产国，中国2014年的农作物秸秆产量为7亿t[1]，如何有效利用这些巨量的秸秆已成为紧迫的环境、资源和社会问题[2]。秸秆类生物质资源在转化利用过程中，破除抗降解屏障以及纤维素等组分的增值化开发一直是亟待攻克的瓶颈[3-4]。研究表明，经SO3微热爆联合稀碱溶液预处理的稻草秸秆[5-6]，在经纤维素酶的水解糖化后所得的糖化液，不仅葡萄糖含量高而且糠醛、乙酸等发酵抑制物含量低，完全可以应用于头孢菌素C（cephalosporin C，CPC）的发酵，作为原料丰富且廉价的碳源替代物[7]。

作为当前最为重要的β-内酰胺类抗生素，现在全世界每年生产约2 500 t头孢菌素衍生物，在过去的几十年中，通过培养基与发酵工艺的优化，CPC的发酵效价得以大幅改善，产量更是增加了一倍以上[8-9]。SHIN H Y等[10]研究发现，在黄曲霉M35产生CPC的过程中，粗甘油可以代替蛋氨酸和植物油，成为半胱氨酸和碳源。CUADRA T等[11]以甘蔗渣为载体研究pH调节和养分浓度对固态发酵产CPC的影响，结果发现CPC产量从468 μg/g升至3 200 μg/g。LOTFYW A等[12-13]利用甜菜糖蜜作为产黄顶孢菌生产CPC的新型碳源，并采用响应面法研究了发酵培养基组成、接种浓度、初始pH和通气率对CPC产量的影响。

在本课题组前期的研究基础之上，本研究旨在采用更为廉价易得的培养基，通过响应面法进一步揭示碳源替代后CPC发酵效价改变的原因所在，以寻求培养基组分含量与效价之间的关系，确立最优的培养基组成[14]。为真正实现工业发酵中利用秸秆棕纤维素替换淀粉作为碳源提供依据，对促进我国秸秆增值化利用具有现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

稻草秸秆：中国江苏省连云港市；顶头孢霉（Cephalosporium acremonium）CPCC400039：中国药学微生物菌种保藏管理中心；头孢菌素C标准品（纯度≥99.0%）：上海榕柏生物技术有限公司；D,L-甲硫氨酸、纤维素酶（均为分析纯）：阿拉丁试剂（上海）有限公司；玉米浆、淀粉、葡萄糖（均为生物试剂）、硫酸铵（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；豆油：市售。

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L。

液体种子培养基：葡萄糖5 g/L，蔗糖35 g/L，玉米浆31 g/L，豆油5 g/L，D,L-蛋氨酸0.5 g/L，（NH4）2SO48 g/L，CaCO35 g/L。

标准发酵培养基：葡萄糖40 g/L，糊精20g/L，淀粉30 g/L，玉米浆50 g/L，α-淀粉酶0.2%，豆油50 g/L，（NH4）2SO430 g/L，D,L-蛋氨酸6 g/L，MgSO4·7H2O 3 g/L，ZnSO4·7H2O 0.01 g/L，CuSO4·7H2O 0.02 g/L，MnSO4·H2O 0.01 g/L，KH2PO45 g/L，CaCO35 g/L，FeSO4·7H2O 0.2 g/L。

碳源替代发酵培养基：水解葡萄糖40 g/L，糊精20 g/L，棕纤维素30 g/L，玉米浆50 g/L，纤维素酶0.2%，豆油50 g/L，（NH4）2SO430 g/L，D,L-蛋氨酸6 g/L，MgSO4·7H2O 3 g/L，KH2PO45 g/L，ZnSO4·7H2O 0.01 g/L，CuSO4·7H2O 0.02 g/L，CaCO35 g/L，MnSO4·H2O 0.01 g/L，FeSO4·7H2O 0.2 g/L。

1.2 仪器与设备

LC-16高效液相色谱（highperformanceliquid chromatography，HPLC）仪：岛津仪器（苏州）有限公司；ZHJH-C115C超净工作台、ZWY-2102恒温培养振荡器：上海智成分析仪器制造有限公司；YXQ-LS立式蒸汽灭菌器：上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；HC-3018R高速冷冻离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；AUY120分析天平：日本shimadzu公司；SBA-40E生物传感分析仪：山东省科学院研究所；AMR-100全自动酶标分析仪：杭州奥盛仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 秸秆预处理

SO3微热爆：在带有毛玻璃塞的250 mL三口烧瓶中，P2O5（22.5 g）和H2SO4（50.0 g）反应，产生约40.82 g三氧化硫气体，并通入装有1.0 kg稻草秸秆（切成2～3 cm）的反应罐中，秸秆与气体在60 ℃反应1 h。

稀碱法：稻草秸秆在SO3微热爆预处理后，在60 ℃条件下用2%NaOH碱洗220 min，反应罐转速为150 r/min。反应结束后，将稻草用自来水洗涤至中性，并在60 ℃烘干至质量恒定，然后使用试验室粉碎机将样品粗粉碎至约1 mm粒度，于干燥处保存备用。参见文献[15-16]测定水分、灰分、纤维素、半纤维素、木质素含量。

1.3.2 秸秆酶解糖化

在250 mL锥形瓶中加入10 g秸秆棕纤维素粉末，纤维素酶用量20 FPU/g底物，并用柠檬酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH4.8）调节水解体积为100 mL，置于45 ℃，180 r/min的恒温振荡器中酶解72 h。沸水浴10 min结束酶促反应，样品以8 000 r/min离心10 min，收集上清液即为棕纤维素酶解糖化液，4 ℃保藏备用。以稀碱法预处理作为对照组。通过蒸馏水稀释或80 ℃浓缩的方式控制糖化液中的葡萄糖浓度。纤维素糖化率的计算公式如下：

1.3.3 菌株培养条件

顶头孢霉经马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养后，转接液体培养基，在28 ℃、220 r/min的摇床中培养48 h，再接种到发酵培养基，接种量4.0 mL，置于28 ℃，转速220 r/min的摇床振荡培养48 h后，降温至25 ℃，继续培养144 h。

1.3.4 发酵生长曲线及水解液木糖的影响

为了解CPC效价与菌体生长的相关性，替代培养基在发酵过程中每隔12 h取样，检测发酵液中CPC效价及菌体的生物量，其中生物量的测定采用核酸法[17]。以标准发酵培养基为对照组，绘制发酵生长曲线以及效价曲线。

为测定酶解糖化后木糖对替代效果的影响，分别配制木糖培养基、混合糖培养基（葡萄糖、木糖），以标准培养基（葡萄糖）作为对照，接种发酵结束后，测定CPC效价。

1.3.5 头孢菌素C效价测定

头孢菌素C效价的测定采用高效液相色谱法，色谱柱：YWG C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，10 μm）；色谱条件：流动相：85%（V/V）0.2%KH2PO4缓冲液和15%（V/V）甲醇，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，流速：1 mL/min，紫外检测波长：254 nm，柱温：室温，进样量：20 μL。以头孢菌素C钠盐为标准，外标法计算头孢菌素C效价，单位U/mL。

1.3.6 Plackett-Burman（PB）试验设计

本试验选取6种培养基组分为评价因素，CPC效价（Y）为响应值，进行PB试验，优化发酵培养基配方，PB试验设计因素与水平见表1。

表1 Plackett-Burman试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments

1.3.7 最低添加量试验

为降低培养基成本，根据PB试验结果，选取不显著因素，以合理的步长进行试验，得出不显著因素的最低添加量。

1.3.8 最陡爬坡试验

根据PB试验结果，选取显著因素，对其试验结果进行分析并设计，选择合适的步长，通过梯度设计确定试验中心点。

1.3.9 Box-Behnken（BB）中心组合设计

在最陡爬坡试验结果的基础上，进行BB设计并确定重要因素的最佳值，用软件进行二次响应面回归分析，自变量因素和水平见表2。

表2 Box-Behnken设计试验因素与水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments

2 结果与分析

2.1 秸杆预处理及酶解糖化

由于秸秆类生物质的致密结构，导致其纤维组分始终难以被高效转化与水解利用。本课题组基于SO3微热爆技术建立了一种新的秸秆类生物质预处理新方法，对秸秆预处理前后组分含量进行测定，不同方法对结果的影响见表3。

表3 生物质的组分分析Table 3 Compositional analysis of biomass

由表3可知，经预处理后，木质素含量相较原秸秆显著降低至（5.60±0.1）%，去除率达65.91%，而棕纤维素（纤维素与半纤维素）含量基本不变。这表明该预处理在有效破解木质纤维素类生物质抗降解屏障的同时，有效避免了“糖”组分的损失，预处理对秸秆棕纤维素酶解糖化的影响见图1。

图1 预处理对酶解糖化的影响Fig.1 Effect of pretreatment on enzymatic hydrolysis and saccharification

由图1可知，随着时间的延长，经过SO3微热爆＋稀碱预处理的秸秆棕纤维素糖化率为95.13%，稀碱法预处理糖化率为88.45%。这表明，SO3微热爆预处理对稻草细胞壁最外层木质素的去除，增加了纤维素酶的可及性，提升了酶解效率，是一种十分有效的促进秸秆生物转化利用的预处理方法。

2.2 碳源替代对发酵的影响

2.2.1 发酵生长曲线

为探究碳源替代对于顶头孢霉生长代谢的影响，分别测定了菌体在标准发酵培养基和碳源替代培养基中CPC效价及生物量随时间的变化曲线，结果见图2。

图2 顶头孢霉发酵生长曲线及头孢菌素C效价曲线Fig.2 Fermentation growth curve of Cephalosporium acremonium and titer curve of cephalosporin C

由图2可知，碳源的替换对于该微生物的生长代谢有一定影响。碳源替换后，菌体的生物量和CPC的效价均低于标准发酵培养基中的相应值。可能在于半纤维素酶解后所得的木糖对于发酵的抑制，也可能是由于碳源替换后，培养基组成之间存在相互影响，未达到最佳状态。

2.2.2 水解液木糖的影响

为揭示在本研究中木糖的存在对于CPC的发酵是否存在抑制作用，考察木糖对于发酵过程的影响，结果见图3。

图3 木糖对顶头孢霉发酵产头孢菌素C的影响Fig.3 Effect of xylose on cephalosporin C production by Cephalosporium acremonium fermentation

由图3可知，菌株利用单一的木糖作为碳源时，由于顶头孢霉对于戊糖的利用能力不足，CPC效价明显下降。但在相同的碳源浓度下，添加少量的木糖对发酵的抑制作用并不明显，反而在同等葡萄糖浓度下，木糖的添加使发酵效价有所提升。这表明，糖化液中少量木糖含量的存在，对于本研究中CPC的发酵并无抑制作用。在碳源替换后导致发酵效价降低的可能原因就在于培养基组成之间存在相互影响，未达到最佳状态。基于此，特采用响应面法进行了培养基组成优化研究。

2.3 Plackett-Burman试验设计结果与分析

按照Plackett-Burman 试验设计进行试验，结果见表4。根据试验结果进行方差分析，结果见表5。

表4 Plackett-Burman试验设计与结果Table 4 Design and results of Plackett-Burman experiments

表5 Plackett-Burman试验设计方差分析Table 5 Analysis of Plackett-Burman experiments design

由表5可知，PB试验的回归模型P值为0.000 5＜0.05，表明该回归模型是显著的。模型的决定系数R2=0.978 6，说明该模型可解释97.86%的数据，也说明该回归模型的拟合度很好。

其中，A、B、C的P值均＜0.01，则说明这三种组分对发酵的影响是极显著的。究其原因在于水解葡萄糖替代葡萄糖作为速效碳源，为菌体生长的初期提供有效单糖组分，浓度过低会影响发酵前期菌体的生长，但过高的糖浓度则会抑制产物的生成。棕纤维素作为持续碳源，含量过低，会导致菌体生长期间与后续合成CPC时底物供给不足；过高则会造成溶液中固形物含量过高，溶氧水平大幅度降低，限制了菌体的呼吸作用。玉米浆作为氮源，有丰富的氨基酸、蛋白质和微量元素，前期可以刺激菌体大量生长，但过量会导致溶氧抑制、氨基酸抑制等问题。E、F、G对菌株发酵产CPC的影响不显著（P＞0.05）。

2.4 非显著因素的最低添加量

根据表5分析可知，E、F、G为不显著因素，且E和G呈现负效应，F呈现正效应。依据分析结果，对3种组分分别设计合理的步长，进行最低添加量试验，发酵后测定CPC效价，结果见表6。

表6 不显著因素最低添加量试验结果Table 6 Results of the minimum addition of insignificant factors

由表6可知，随着纤维素酶的增加，CPC效价呈现先上升后下降的趋势，当纤维素酶添加量达0.8%时，效价达到最大，为235.71 U/mL。随着豆油含量的增加，效价逐渐增加至最大值251.09 U/mL后下降。当硫酸铵浓度增加时，效价也呈现先上升后下降的趋势，并于添加量10 g/L时达到最大效价235.43 U/mL。为节约培养基成本，后续试验纤维素酶、豆油、硫酸铵的添加量分别为0.8%、25 g/L、10 g/L。

2.5 最陡爬坡试验

表7 最陡爬坡试验结果Table 7 Results of the steepest ascent experiments

由于水解葡萄糖、棕纤维素、玉米浆的浓度对发酵产CPC的影响是显著的，为了进一步优化，对这三种组分进行最陡爬坡试验以确定BB试验的设计原点。由表5可知，A和C呈现负效应，即随着质量浓度的增加，发酵产CPC的效价逐渐下降；而B呈现正效应，随着含量的增加，CPC效价逐渐增加。根据以上分析，设计最陡爬坡试验如表7。由表7可知，当水解葡萄糖为35 g/L、棕纤维素为45 g/L、玉米浆为35 g/L时，CPC效价最高，达261.54 U/mL，即选择第4组试验的用量作为BB设计的中心原点。

2.6 Box-Behnken设计优化培养基组分

根据PB设计以及最陡爬坡试验结果，选择水解葡萄糖、棕纤维素、玉米浆浓度3个因素为自变量，以CPC的效价为响应值，设计了3因素3水平的响应面分析试验，试验结果如表8所示，利用软件对数据进行回归拟合得到回归方程：Y=291.21+19.90A+13.00B+36.81C-6.20AB-21.01AC+2.28BC-40.92A2-38.58B2-33.16C2。

表8 Box-Behnken试验设计与结果Table 8 Design and results of Box-Behnken experiments

对上述二次回归方程进行方差分析，结果见表9。由表9可知，该二次回归方程模型极显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P=0.097 9＞0.05），回归方程的相关系数R2=0.990 0，调整相关系数R2adj=0.977 1，说明该回归方程拟合度很好，能够较好的反应CPC效价与各因素之间的线性关系。由试验值可知，水解葡萄糖（A）、棕纤维素（B）、玉米浆（C）的添加量对CPC效价有极显著的影响（P＜0.01）。二次项A2、B2、C2（P＜0.000 1）对CPC效价的影响也极显著（P＜0.01）。根据F值大小各因素对发酵产CPC效价的影响程度为：玉米浆（C）＞水解葡萄糖（A）＞棕纤维素（B）。因素AB的交互作用对CPC效价有极显著的影响（P＜0.001），而AC和BC之间的交互影响不显著（P＞0.05）。

表9 Box-Behnken试验设计结果的方差分析Table 9 Variance analysis of Box-Behnken experiments design results

为直观的反应出各因素及其交互作用对响应值的影响结果，以CPC效价为指标，利用软件绘制三维响应面及其等高线图见图4。等高线的形状可以反映出各因素的交互作用对响应值的影响[18-20]。

图4 各因素交互作用对头孢菌素C效价影响的响应面和等高线Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on cephalosporin C titer

由图4a可知，响应面等高线接近于圆形，说明交互作用不明显，当水解葡萄糖的量不变时，随着棕纤维素质量浓度的增加，效价先增加后减小，当棕纤维素的量不变时，效价随着水解葡萄糖浓度的增加也呈现先增加后减小的趋势。由图4b和图4c可知，水解葡萄糖和玉米浆的交互影响及棕纤维素和玉米浆的交互影响同样存在相同的变化趋势。由图4b分析可知，水解葡萄糖和玉米浆的交互影响显著，这和方差分析结果保持一致。

2.7 验证试验

通过软件分析可得顶头孢霉出产CPC的最佳培养基配方：水解葡萄糖添加量35 g/L，棕纤维素添加量46 g/L，玉米浆添加量38g/L。在最优条件下所产CPC效价的理论值为303.07U/mL，为上述研究中所产效价最高。为了验证模型的可靠性，在最佳的培养基配方条件下进行3组摇瓶平行试验，测定发酵液中CPC效价，得到的效价平均值为298.34 U/mL，与理论值（303.07 U/mL）的误差仅为1.56%，表明试验结果与此模型相符度高，能够较好的预测实际发酵情况。