一种含双歧杆菌的三联酸奶直投发酵剂制备研究

文/邓小华 郑巧双 郭 荣 余 薇 潘笃杰

（武汉工控工业技术研究院有限公司；湖北省工业微生物菌种保藏与研究中心）

酸奶作为乳酸菌发酵最为常见的食品，其保健作用越来越受到重视。双歧杆菌是对人体有益的无鞭毛革兰氏阳性菌[1]，属于厌氧菌的一类，其不同种类的耐氧能力不同，其中长双歧杆菌具有较好的耐氧性能[2]，能抑制体内有害菌的生长，具有调节肠道功能[3]、调节免疫力[4]，保护肝脏[5]，改善维生素代谢和抗癌[6]等功能。因此，本文采用自分离的嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和双歧杆菌进行了一种含有长双歧杆菌的三联酸奶直投式发酵剂的制备、复配和应用，以提供一种制备含双歧杆菌的三联酸奶直投发酵剂的工艺方法。

1 试验材料

1．1 菌种

嗜热链球菌（ST）、德氏乳杆菌保加利亚亚种（LB）、长双歧杆菌（BB）：湖北工业微生物菌种保藏与研究中心。

1．2 牛奶

本试验采用全脂牛奶。

1．3 试剂

MRS琼脂培养基（用于乳酸菌检验与培养）：蛋白胨10.0 g，牛肉提取物10.0 g，酵母提取物5.0 g，葡萄糖20.0 g，柠檬酸三铵2.0 g，乙酸钠5.0 g，MgSO40.1 g，MnSO40.05 g，K2HPO42.0 g，吐温80 1.0 g，pH值6.5。

莫匹罗星锂盐改良MRS琼脂培养基（用于双歧杆菌检验）：将莫匹罗星锂过滤除菌后，使用前加入MRS培养基中混匀备用。

MC培养基（用于嗜热链球菌检验）：大豆蛋白胨5.0 g，牛肉浸粉3.0g，酵母浸粉3.0 g，葡萄糖20.0 g，乳糖20.0 g，碳酸钙10.0 g，琼脂15.0 g，中性红0.05 g，pH值6.0±0.1，25 ℃。

原料：葡萄糖、糊精、玉米淀粉等。

1．4 试验设备

发酵罐、高速冷冻离心机、造粒机、混匀机、冷冻干燥机、厌氧工作站、厌氧培养箱、生物安全柜、分析天平、V型混合仪、湿热高压灭菌器、干燥箱等。

2 试验方法

2．1 菌种发酵

将3 种菌混合发酵，按照不同比例进行接种，发酵结束后进行活菌计数，确定3 种活菌总数较高以及双歧杆菌含量较高为最佳的发酵接种条件；另将3 种菌分别进行纯菌种发酵，以获得菌粉。

表1 不同原料比例对赋形剂制作的影响

图1 不同接种比例混合发酵活菌的比较

图2 纯菌种发酵活菌的比较

2．2 活菌计数法

采用《GB 4789.35—2016食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》中的方法进行检验[7]。

2．3 稀释粉配方

对葡萄糖、糊精、淀粉等原料进行配比，比例分别为1:1:1、1:2:1、1:1:2、2:1:1，加入1.0%的无菌水进行造粒，烘干，80目过筛整理以及微波灭菌，对比选择造粒成型较好、不易散的配方。

2．4 不同配方的菌剂发酵酸奶效果对比

对比不同配比比例的直投发酵剂效果，将各纯菌粉稀释至1.0×109CFU/g，进行配比混合。有报道称嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的配比为1:1时发酵效果较好[8]，因此按照菌粉质量配比（ST:LB:BB）为1:1:0.5、1:1:1、1:1:3、1:1:6等制成直投菌发酵剂，0.05%接种量接入灭菌的全脂牛奶中，观察对比。

对比纯菌复配的直投发酵剂和混菌发酵获得的直投发酵剂发酵酸奶的效果。将2 种发酵剂0.05%的接种量接入无菌的脱脂牛奶中进行发酵，比较发酵凝固时间、酸度以及双歧杆菌的活菌计数，确定最优的直投发酵剂工艺。最后采用酸碱滴定法进行酸度检测[9]。

3 结果与讨论

3．1 不同接种比例对混合培养发酵的影响

不同的接种量会对3 种菌在培养基中的发酵生长有一定的影响。从图1中可以看出，长双歧杆菌与嗜热链球菌生长具有一定的协同性。据文献报告显示，嗜热链球菌和双歧杆菌的发酵有一定的相互促进作用[10]。从图中看出，接种比例约为1:1:3时，发酵后总菌数较高，双歧杆菌的浓度也较高，但发酵后的3 种菌的比例稳定性较差，其不同批次有小幅变化。

图2显示，单独发酵后的活菌总数与混合发酵的活菌总数水平接近。

3．2 不同原料配比研究赋形剂的制作工艺

表1结果显示，葡萄糖、糊精和淀粉比例为1:2:1进行赋形剂造粒，其可溶性、崩解效果均为最佳，而糊精和淀粉较多的配方，颗粒成型较好，过筛整粒时，成型的颗粒细小，质感较好，破碎较少，灰尘少，直投发酵剂效果最佳。

图3 不同菌种比例制备的菌剂发酵酸奶效果对比

3．3 不同配方纯菌种菌粉配置的发酵剂发酵酸奶对比

图3结果显示，在发酵剂复配时，双歧杆菌含量较高有利于缩短发酵时间，并且接种较高的长双歧杆菌时，酸奶发酵后的长双歧杆菌含量也相对较高，通过对比酸度和菌体总数，可以看出，在1:1:3配比时，该类直投发酵剂发酵酸奶的效果较好。

3．4 不同工艺制作直投菌剂发酵酸奶的比较

图4结果可知，2 种工艺制作的发酵剂发酵酸奶时间的差距不大，其中纯菌复配工艺发酵剂发酵的酸奶时间要相对较快。通过比较混菌发酵工艺发酵剂发酵后的长双歧杆菌数量，发现纯菌复配发酵剂有明显优势，而混菌发酵工艺发酵剂发酵双歧杆菌的含量较少，且稳定性不如纯菌复配发酵剂，两者酸度有一定差别。

4 小结

含有双歧杆菌的复合发酵直投菌发酵的酸奶具有各种保健作用[11]，有利于人体健康。本文通过比较上述2 种工艺制作发酵剂的结果可知，纯菌种复配直投发酵剂，其活菌含量稳定，各菌种比例合适，在酸奶发酵应用中具有发酵时间短、酸度高以及高含菌量的长双歧杆菌的优点，是一种较好的直投发酵剂制备方式。而混菌发酵工艺制备的直投发酵剂具有经济性和方便性，制作工序简单，成本低等优点，但需要克服直投菌剂中各批次之间的可控性等问题，具有较好的可研究性。