牛支原体乳房炎的检测及防控

文/刘彩娟 王永信 任 亮 付文国 胡格吉勒 高满慧

（黑龙江克东和平原生态牧业有限公司）

支原体为自然界中独立生存的最小原核微生物，拥有能够进行自我复制的最小基因组[1]。支原体能攻击宿主细胞，引起宿主细胞的免疫反应并损害宿主细胞，以便在宿主细胞内生长繁殖[2]。其中牛支原体（Mycoplasma Bovis）是一种主要感染牛呼吸道的病原体[3]，能够持续感染宿主[4]，并引发包括牛肺炎、乳房炎在内的多种慢性疾病[5，6]。泌乳牛无法从疾病中及时恢复，是牛支原体乳房炎的主要特征，感染支原体2 周后受到感染的乳房会萎缩，在之后的泌乳期无法恢复到之前的产奶量。被感染牛只只能被淘汰或被屠宰，给牧场造成经济损失[7]。目前由于支原体培养及检测方法较繁琐，其在牧场乳房炎奶样的流行情况和流行的优势病原种类报道也较少，且没有更好地、更有效地控制牛支原体乳房炎的方法。本文结合4 家规模化牧场的支原体检出情况，初步总结防控经验，以期能为同行提供参考借鉴。

1 材料与方法

1．1 样品来源

2013—2019年，牧场兽医人员对4 家规模化牧场在挤奶时发现的具有不同临床症状的乳房炎牛只，在不使用任何药物前第一时间进行奶样采集，送往实验室进行细菌分离、培养。4 家规模化牧场的饲养管理方式基本相同。

1．2 样品采集

采样人员洗手后带上一次性手套，用防水记号笔标记采样管，标明采样日期、牛号和采样乳区。去除附着在乳房和乳头部位的粪污、垫料，用挤奶前药浴液药浴乳头。使用一次性纸巾或毛巾擦拭每个乳头，特别要注意乳头末端，确保没有药浴液残留在乳头上。弃掉头3～4 把奶，防止乳头、乳池内的细菌污染奶样。使用75%酒精棉球或纱布消毒乳头10～15 s，可更换新的棉球或纸巾进行消毒。先从乳头远端开始消毒，然后是乳头孔附近，以避免消毒好的乳头再次污染，每消毒1 个乳头使用1 个新的棉球，确保乳头末端不能有酒精滴落。消毒后待乳头干燥15 s后取样，采样时再打开采样管盖子，避免乳头末端接触采样管。保持采样管与牛乳头呈45°角，防止粪污或牛毛落入管内。尽快采样，先采近端乳头，而后是远端乳头，采样至1/3管即可。采样结束后立即将采样管置于冰箱内，将检测培养。

1．3 检测试剂和耗材

1．3．1 培养基

血平板培养基、麦康凯培养基、支原体培养基等，均为市售商品化成品，直接使用或按照说明书进行配置。

1．3．2 试剂及耗材

革兰氏染色液、香柏油、二甲苯、过氧化氢（3%H2O2）、稀释液（生理盐水/PBS/蛋白胨水/林格氏液）、蒸馏水等。

表1 2013—2019年不同牧场乳房炎奶样无生长和支原体检测结果

1．4 检测设备

生化培养箱：型号为LRH-150，上海一恒科学仪器有限公司；电子显微镜：型号为XSPBM-2CA，上海彼爱姆光学仪器制造有限公司；超净工作台：型号为SW-CJ-2D，苏州净化设备有限公司；高压蒸汽灭菌器：型号为LDZX-75KBS，上海申安医疗器械厂；二氧化碳培养箱：型号为BPN-80CH，上海一恒科学仪器有限公司；体式显微镜：型号为XTZ-D，上海光学仪器厂。PCR检测在南京农业大学完成。

1．5 统计方法

试验数据采用EXCEL 2003软件进行整理，运用SAS 8.2软件包中的平衡试验设计方差分析过程（ANOVA）进行统计分析，均值的多重比较采用Duncan氏法进行。

2 结果

2．1 不同牧场乳房炎奶样无生长和支原体检测结果

2013—2019年不同牧场乳房炎奶样无生长和支原体检测结果如表1所示。由表中数据可以得出，2013年C牧场无生长检出率为14.89%，支原体检出率为3.71%；D牧场无生长检出率为24.69%，支原体检出率为0.56%。2014年C牧场无生长检出为31.82%，支原体检出率15.18%；D牧场无生长检出率为20.66%，支原体检出率仅为0.29%。D牧场在2015、2016年无生长检出率分别为32.84%、36.07%，与其他牧场相比较高，但支原体检出率分别为0.1%、0%。C牧场在2015年无生长检出率在11.11%，支原体检出率5.32%，支原体检出率呈下降趋势，至2016年支原体下降为0.27%。2013—2019年A、B牧场支原体检出率均为0%。2017—2019年C、D牧场支原体检出率均为0%。

表2 2013—2019年不同牧场不生长和支原体检出率对比

2．2 金黄色葡萄球菌感染率较高牧场的全面筛查结果

在2013年12月底，针对金黄色葡萄球菌感染率较高的牧场进行牛只的全面筛查，结果见表2。由表可知，B、D牧场的无生长检出率相对A、C牧场较高，差异显著（P＜0.05），而C牧场的支原体检出率显著高于A、B、D牧场（P＜0.05）。

2．3 乳房炎个体牛只奶样及大缸奶样支原体的检测情况

2019年抽检4 个牧场乳房炎个体牛只奶样及大缸奶样支原体的检测情况如图1～3。结果显示，A、B、C、D牧场的乳房炎个体牛只奶样及大缸奶样支原体的PCR检测结果均为阴性。

3 讨论

本文中B、D牧场的无生长检出率相对A、C牧场较高，差异显著（P＜0.05）。乳房炎奶样无生长主要分为以下几个情况：奶样中菌量过少，低于可检测范围；奶样没有被合理储存，导致细菌死亡；在奶样中存在抗生素；奶牛自身免疫系统已将病原体菌清除，但依旧存在假阴性结果，一般在肠道菌群和金葡萄球菌感染乳房炎病例中常见。某些病原菌需要特殊的培养条件，如支原体。从本文无生长结果较高，但是其支原体检出率相对较低的结果可以看出，无生长检出率与支原体检出率无明显的正相关趋势。因此无生长检出率偏多，不能确定均是由支原体造成的感染，支原体的分离培养还需专门的培养基。此外，本文中B、D牧场的无生长检出比例较高，还需要分析牧场采样、保存环节及其他优势致病菌。

C牧场支原体检出率显著高于A、B、D牧场（P＜0.05），2014年最高检出率达到15.18%，随后逐渐下降，到2017年达到未检出。D牧场支原体在2013年有检出，而2015年下降到0.1%，运用PCR检测确定C、D牧场乳房炎主要感染Mycoplasma Bovis类支原体，而Mycoplasma Leachii类支原体为阴性。2016年以后均为检出率0%，且2019年送检4 个牧场的乳房炎奶样及奶仓支原体PCR检测结果均未检出，与牧场培养方法的结果一致，这说明C、D牧场的乳房炎支原体感染得到了有效的控制。

防控支原体感染，首先需要做好检测：一是进行针对性检测，主要针对乳房炎反复发病，奶样感官评定出现豆腐渣乳、水样乳及气味恶臭等，但细菌分离培养不出细菌，已排除不是金黄色葡萄球菌感染，产奶量较低的牛只优先采样，检测是否是支原体感染。二是每月对乳房炎发病牛只进行支原体筛查。三是每周定期对奶仓混合样进行支原体筛查，如检测出支原体，则应对每舍牛的混合奶样进行筛检，筛查存在阳性牛只的牛舍，并逐级细分到该舍每头牛，如每周对奶仓混合样进行支原体筛查中未检测出支原体，则检测频率调整为每月定期筛查。四是外来引进牛只，或者不同牧场之间转群，要提前做好筛查、检测，无检出支原体后再归群。其次，要做好挤奶操作的卫生工作，对于支原体阳性牛应隔离最后挤奶，而对于无胎牛支原体阳性牛不再参配到无奶时淘汰，对有胎阳性牛产犊时初乳废弃、隔离，最后挤奶。Yuri等（2020）研究已经再次证实，做好挤奶的卫生控制，能够有效防止奶牛之间的支原体传播[8]。对于因支原体感染的反复发作、久治不愈的乳房炎牛只，或者肺炎、多发性关节炎、肢蹄病、乳房炎等存在多种慢性疾病的牛只，应及时淘汰。C

图1 A牧场乳房炎奶样及奶仓支原体PCR检测结果

图2 B牧场乳房炎奶样及奶仓支原体PCR检测结果

图3 C、D牧场乳房炎奶样及奶仓支原体PCR检测结果